ftlAYSARDM. METC^LÎ, -V.. ■ .^? <^ tf . TRAITÉ DE MICROBIOLOGIE à 6 I , f^ 1> 8 à" TRAITE DE MICROBIOLOGIE PAR E. DUCLAUX Membre de l'Institut Directeur de l'Institut Pasteur Professeur à la Sorbonne et à l'Institut agronomique TOME PREMIER MICROBIOLOGIE GÉNÉRALE PARIS MASSON ET G'% EDITEURS LIBRAIRES DE L'ACADÉMIE DE MÉDECINE 130, Boulevard St-G-ermain 1898 PRÉFACE Un traité de microbiologie doit-il être un compendium, un résumé analytique de tous les travaux publiés sur la ma- tière, et se borner à signaler les faits observés, sans pren- dre parti entre eux quand ils sont discordants? Doit-il, au contraire, chercher à les relier par un lien provisoire qu'on appelle une théorie, et en tenter la synthèse? Les deux opi- nions peuvent être mises en balance, ayant chacune ses avantages et ses inconvénients. Par goût, par souci de pro- fesseur, j'ai adopté la seconde, et je voudrais montrer que malgré sa jeunesse et sa croissance rapide, la microbiologie est déjà une science constituée, où tout se relie et s'en- chaîne. Celte détermination avait une conséquence devant laquelle je n'ai pas reculé: elle m'interdisait toute collaboration. Il faut de l'unité dans une œuvre pareille, et un traité rédigé par plusieurs savants en manque d'autant plus que ces sa- vants sont plus compétents et plus maîtres de leurs idées : en unissant leurs efforts, ils peuvent donner rapidement, de Tétat actuel de la science, un tableau très vivant, mais né- otissairemenl un peu confus. Je serai obligé d'y mettre plus de temps, mais tout le tableau sera de la même main. Je crois que cet exposé méthodique est possible. La mi- crobiologie progresse vite, mais harmoniiiuement. C'est un arbre à croissance rapide, qui peut bien changer, d'année en année, de port et de physionomie, mais qui garde ses racines, son tronc, ses maîtresses branches, auxquelles la sève arrive toujours par les mêmes voies. Un exposé dogmatique doit II PREFACE mettre en lumière ce qu'il y a de permanent dans les sour- ces profondes de l'être, etde stable dans les diverses manifes- tations de sa vie. Je m'y étais essayé, il y a dix ans, dans un Traité (k microbiologie ^ aujourd'hui épuisé. En le recommen- çant sur d'autres dimensions, je ne vois pas que j'aie à en changer beaucoup le plan et les divisions principales. Je serai seulement obligé de lui donner beaucoup plus d'ampleur. Je commence par un traité de microbie géné- rale. Le tome second com()rendra l'étude des diastases, des toxines et des virus. Puis viendront la fermentation alcoo- lique et les autres fermentations. J'espère pouvoir publier un volume chaque année. Quelque soin que je prenne à les tenir tous au courant de la science, il est clair que l'ouvrage sera à peine terminé qu'il faudra le recommencer. Mais c'est un soin que je compte bien laisser à d'autres. A vrai dire, je crois que personne n'y songera. Si la mi- crobiologie continue à marcher du pas qu'elle a pris, il sera bientôt aussi impossible à un seul savant d'en faire le bilan complet, qu'il le serait, en ce moment, à un physicien ou à un chimiste, d'écrire un traité de physique et de chi- mie à la hauteur de nos connaissances actuelles. Chacune des grandes divisions de ces sciences peut occuper la vie d'un homme, et quand on souge que la microbiologie se rat- tache par l'étude des diastases à une des régions les plus in- connues de la chimiy, par celle des matières albuminoïdes à l'une des plus difficiles, par l'étude microbienne du sol, de l'air et des eaux à l'hygiène générale, par l'étude des ferments à toute la physiologie, par celle des virus et des venins à toute la médecine, on conclura que le jour est pro- che où un microbiologiste devra être tant de choses à la fois qu'il ne le pourra plus, et qu'il devra choisir. Mais pourquoi, me dira-t-on peut-être, ne pas prendre tout de suite ce parti et ne pas donner vous-même cet exemple ? C'est qu'il n'y a à la Sorbonne qu'une seule chaire de chi- mie biologique, et que celui qui a l'honneur de l'occuperdoit passer en revue, dans ses cours, l'ensemble de la science. PRÉFACE [II Cette révision doit se faire à grands traits ; elle implique par là une méthode d'exposition qui mette en évidence les grandes lignes, en supprimant les redites et les détails inu- tiles. Les lecteurs de ce livre s'apercevront, je l'espère, qu'il a été parlé avant d'èti'e écrit. Et voilà qui explique la genèse de cet ouvrage, et en indique en même temps le caractère. C'est un cours de Sorbonne dans lequel le souci du lecteur a succédé au souci de l'auditeur. Paris, Novembre 1897. TRAITÉ DE MICROBIOLOGIE CHAPITRE I \^\ ..^j^^ h^l ACTIONS DE FERMENTATION JWasj 1. Historique. — Les phénomènos de fermentation sont aussi anciens que le monde, et ont dû être observés par les pre- miers hommes qui ont préparé du jus de certains fruits sucrés, par exemple, celui du raisin. L'espèce de bouillonnement qui s'y produit spontanément, le soulèvement que subit la masse entière, la production continue de petites bulles gazeuses qui viennent crever à la surface, leur ont rappelé l'état d'un liquide placé sur le feu. Il est curieux de voir cette analogie entre l'ébullition et la fermentation alcoolique se traduire dans les langues les plus an- ciennes. Le nom hébreu du vin {i/ine) vient d'un verbe qui si- gnifie faire effervescence, se soulever, bouillir, et il doit avoir des racines profondes dans les âges, car il a donné le nom du vin à presque tous les peuples de l'Occident. De son côté, le mot fer- mentation, plus récent, vient de fervere, bouillir. Le nom aile- ' mand de la levure, Ae/>, vient de /i/ieVjsien est poussée beaucoup moins loin. \lm'per(jillus utilise ou peut utili- ser toute la chaleur produite par la combustion complète du sucre au moyen de l'oxygène de l'air ; le ferment acétique n'uti- lise que la chaleur de la combustion incomplète qui transforme l'alcool en acide acétique. Il y a donc de ce côté, une cause d'infériorité que compense en partie l'augmentation de combus- tible. C'est ainsi qu'une machine à vapeur qui brûlerait incom- plètement son charbon devrait, ])our le même travail, en con- sommer davantage. GÉNÉRATION SPONTANEE 97 La disproportion augmente encore quand intervient, non plus, comme dans les exemples qui précédent, une oxydation au moyen de l'oxygène gazeux, mais une oxydation partielle au moyen de Foxyg-ène déjà entré en conil)inaison dans la substance, comme c'est le cas dans la fermentation alcoolique, C^H'-O" = 2C-irO + 2C0- où tout Toxygène qui se dégage dans l'acide carbonique est fourni par le sucre lui-môme. Dans ce cas c'est une combustion intérieure qui intervient, laquelle tout naturellement produit moins de chaleur qu'une combustion faite avec l'oxygène de l'air. Le poids d'aliment transformé pour produire une certaine quan- tité de chaleur devra donc être plus grand. Enfin, quand, comme c'est le cas pour la levure, cette com- ])ustion intérieure est produite par une diastase qui, une fois formée, peut agir d'une façon indéfinie, et en dehors des besoins de la cellule qui l'a produite, le poids de l'aliment transformé peut devenir encore plus grand. C'est alors comme si une ma- chine à vapeur mettait le feu au tas de charbon destiné à l'ap- provisionner. Si on songe que ces actions de diastase sont probablement présentes dans toutes les fermentations, qu'il existe probablement un diastase lactique, butyrique, etc., on voit que par là aussi, la disproportion entre le j>oids d'aliment consommé et le poids de cellules actives va en s'exagérant. Mais en dehors de ces causes de disproportion, tenant au mode de destruction de l'aliment, il y en a qui sont propres à la cellule, et qu'il ne faut pas oublier. En allant au fond des choses, ce sont même celles-ci qui dominent. 11 y a, nous venons de le voir, disproportion entre le poids du sucre et le poids de levure dans la production de l'alcool, disproportion entre le poids de l'alcool et le poids du ferment acétique dans la production d'acide acé- tique. Nous pouvons faire brûler l'alcool par r aspergillus nifjer et retrouver encore la même disproportion entre le poids de l'aliment et le poids du végétal. Le fait essentiel, c'est qu'il y a encore une grande disproportion entre le poids de sucre et le poids total des trois catégories d'êtres qui arrivent à le détruire. C'est cette disproportion qui permet aux infiniment petits de 7 98 CHAPITRE IV suffire à la tâche qui leur incombe, de même que c'est elle qui fait, qu'ils sont restés aussi longtemps méconnus ou ignorés. BIBLIOGRAPHIE Aristote. Opéra omnia. Meteorol. Lib. de Cœlo, chap. II et XII. — Histoire des animaux. Traité de la génération. Redi. Exferienzi inlorno alla generazione degli insetli, Florence, 1688. — Osservationi intorno animali viventi che si trovano negli animali vivenli, 1681. Vallisnieri. Bialogi fra Malpiglii e Plinio, intorno la curiosa origine di molti inseiti. Venise, 1700. — Considerazioni ed esperienze intorno aile generazione dei vermi ordinari del corpo umano. Padoue, 1710. SWAMMERDAM. Bihlia naturœ, seu natura insectorum. Leyde, 1737. LeuvenhoECK. Arcaiia naturœ détecta. Deljihis Batavorum, 1680. Needham. Nouvelles découvertes faites avec le microscope. Leyde, 1737. — Notes sur les nouvelles découvertes microscopiques de Spallanzani. — Nouvelles recherches physiques et mathématiques sur la nature. Paris, 1768. BuFFON. Œuvres complètes, t. II. Spallanzani. Opuscules de physique animale et végétale. Pavie, 1787. — Observations et expériences sur les animalcules. SCHULTZE. Annales de Poggendorff, 1836. — Notice on tke resuit of an expérimental observation made regarding equivocal generacion. Traduit dans les Ann. des se. nat., 2» s. Zoologie, t. VIII, p. 320. SCHWANN. Ann. de Poggendorff, t. XLI, 1837. HelmHOTTZ. Journal fur prakt. Chemie, t. XXXI, p. 429, 1843. SCHRôDER et Van Dusch. Ayin. der Chemie und Pharmacie, t. LXXXIX, p. 232, 1854. POUCHET. Héterogénie, ou Traité de la génération spontanée. Paris, J.-B. Bail- lière, 1859. Pasteur. Examen de la doctrine des générations spontanées. Annales de chimie et de physique, 3° s., t. LXI^'', 1882. Discussions relatives à la génération spontanée. Voir jjassim. Comptes-rendus, depuis 1863. TyndalL. Essaijs on the matler floating in air, 1881. Chamberland. Thèse de doctorat. CHAPITRE V MÉTHODES DE CULTURE Nous avons vu plus haut que notre technique actuelle est née des études faites sur la génération spontanée. Il n'entre pas dans le plan de cet ouvrage de la décrire dans tous ses détails et dans toutes ses finesses. J'en donnerai seulement les traits principaux, en les rattachant aux principes sur lesquels ils reposent. Nous avons vu, par exemple, qu'à cause de l'existence des spores, surtout de celles ànbacillus siibtilis et d'autres espèces ana- logues, qui sont très résistantes à la chaleur, il était prudent de n'opérer sur aucun liquide qui n'ait été chauffé à 120'', ou stéri- lisé par la méthode de Tyndall, par plusieurs chauffages succes- sifs à 100°, ou fdtré au travers d'un diaphragme poreux. Nous sa- vons aussi qu'il faut n'employer aucun corps solide qui n'ait été au préalable porté à 160° ou 180°, de façon à détruire les germes qu'il porte sûrement à sa surface, et qui, chauffés à sec, sont infi- niment plus résistants que chauffés à l'état humide. Nous savons enfin que le coton est un excellent filtre pour les germes aériens. 45. Stérilisation par diaufTage. — Pour le chauffage à sec, on emploie d'ordinaire un vase cylindrique en tôle, léché directe- ment par une flamme de gaz sur sa base, et contenant soit un faux-fond percé de trous, soit un panier à claire-voie dans lequel on dispose les vases ou objets k flamber. 11 faut fermer avec un tampon de coton toutes les ouvertures qui supportent ce mode de bouchage. Les verres à pied, les boîtes à couvercles, les vases à précipité seront simplement couverts d'un capuchon rabattu de papier à filtre, ou plies dans ce papier. A la condition de traiter avec ménagement ces fermetures incomplètes, de ne pas décou- vrir les objets, et de les conserver à l'abri des courants d'air dans une armoire close, on peut en retirer à peu près les mêmes avantages que des fermetures au coton. 100 CHAPITRE V Dans tous les cas, il faut arriver, dans le chauffage, à une tem- pérature qui commence à roussir le coton ou le papier. On laisse refroidir dans le four à flamber, de façon que l'air qui rentre dans les vases par refroidissement soit autant que possible de Tair flambé et, par conséquent, pur de germes. Pour le chauflage des liquides, on se sert d'ordinaire d'un au- toclave, dont il existe divers modèles, tous très pratiques. Un pa- nier ou des (ioubles-fonds percés de trous souiiennent les vases ou flacons remplis. Il y a au fond deux travers de doigt d'épais seur d'eau, et le chautfage se fait d'ordinaire au gaz. Une bague en caoutchouc, serrée par des boulons, assure l'étanchéité du couvercle, qui doit porter un robinet d'évacuation, une soupape de sûreté, et un manomètre indicateur de la pression, et par là de la température. Il faut ne jamais oublier, dans le maniement de cet appareil, cette loi physique importante que si, dans un espace clos, la pression est nécessairement la môme partout, la température nest aussi partout la même que s'il n'y a pas autre chose que de la vapeur dans tout l'espace, et si on en a bien évacué tout l'air. C'est la vapeur qui, en se répandant partout, régularise la chaleur en se condensant sur les points les plus froids, suivant le principe de la paroi froide. Si elle est empêchée d'y arriver ou de s'y renouveler suffisamment, par l'existence d'un matelas d'air, il se produit, malgré l'égalité de pression, des inégalités de tempé- rature d'autant plus redoutables qu'on ne dépasse pas beaucoup, pour des raisons d'économie, la température limite, et que quel- quesdegrés de moins, en un point quelconque où on aurait laissé de l'air, peuvent y laisser persister des germes. La condition d'équilibre nécessaire et suffisante dans une masse d'air et de vapeur, c'est que la somme des pressions de l'air et de la vapeur en divers points soit constante. Mais cette uniformité de la pression peut s'accompagner d'une très grande inégalité dans la distribution des températures. Pourcn prendre un exem- ple classique, dans un alambic relié à son serpentin, la pression est la même partout; c'est la pression atmosphérique. Mais la température, qui est de lOCau voisinage de la surface d'ébulli- tion de l'eau, peut n'être que de 10" à l'extrémité ouverte du ser- pentin, en passant dans l'intervalle par tous les degrés intermé- diaires. C'est qu'au voisinage du liquide bouillant, il n'y a que METHODES DE CULTURE 101 de la vapeur: à l'extrémité ouverte du serpentin, il n'y a que de l'air, et, entre les deux, existent des mélanges où la vapeur ne peut atteindre que le maximum correspondant à la température du point considéré, l'air intervenant pour combler la difTérence entre la pression de la vapeur et la pression atmosphérique. Il faut donc, si l'on veut être sûr de l'uniformité des tempéra- tures par l'uniformité de la pression, évacuer tout l'air, tant à l'intérieur des vases qu'à leur extérieur, par une ébuUition pro- longée pendant quelques minutes sous la pression atmosphé- rique : c'est à cela que sert le robinet d'évacuation. Quand l'ap- pareil est purgé, on le ferme. La soupape de sûreté assure que la pression et la température ne dépasseront pas le degré voulu, qui est en général de 120" : on laisse une minute ou deux la va- peur s'échapper par la soupape. Puis on éteint et on laisse refroi- dir. Il est bon de rouvrir le robinet d'évacuation quand la tem- pérature est redescendue à 100". Pour stériliser par la méthode de Tyndall, il suffit d'une mar- mite de fer-blanc dans laquelle on met une couche d'eau, puis, sur un double fond, les liquides à stériliser. Onleur applique gé- néralement trois chauffages à 100", de cinq minutes chacun, à 24 heures de distance l'un de l'autre. "46 Stérilisation par filtration. — Si on réussit parfois à stériliser un liquide par filtration au travers d'une cloison po- reuse, ce n'est pas, comme on le croit souvent, que les pores dont cette paroi est creusée soient de dimensions inférieures à celles des plus petits germes, et les arrêtent à la façon dont un crible arrête les grains de blé. Au regard de la dimension moyenne des spores, les pores de la substance poreuse la plus fine sont comme des tunnels vis-à-vis des wagons. Si les germes s'arrêtent sur les parois, c'est, comme nous le verrons plus tard, qu'ils y sont attirés par une force d'adhésion particulière qui les y maintient collés et adhérents, de sorte que le courant liquide qui les em- porte s'en sépare et ne peut plus les reprendre. Il en est d'autant plus facilement dépouillé que les porcs sont plus fms, plus irré- guliers, plus rugueux à leur surface. La puissance d'adhésion dépend aussi de la nature de la substance filtrante. Le papier comprimé, la terre d'infusoires, et surtout la porcelaine poreuse remplissent toutes ces conditions, et peuvent servir à fabriquer des filtres stérilisateurs. 102 CHAPITRE V On donne naturellement au filtre la forme qui présente, pour le même poids de matière, le maximum de surface filtrante. Sous ce point de vue, la forme cylindrique est préférable à la forme sphérique. Beaucoup de filtres ont la forme de bougies creuses, d'épaisseur d'autant plus faible que la matière est plus fine, et par conséquent, traversée de poresplus étroits. Ces bougies peu- vent être moulées ou tournées. Ce sont les dernières qui sont les meilleures, car elles proviennent de l'application successive, sur le moule, de plusieurs couches, qui corrigent mutuellement leurs défauts. On essaie, dans tous les cas, chaque bougie avant de s'en servir, en y insufflant de l'air au moyen d'une poire de caoutchouc, après l'avoir immergée dans l'eau. La moindre fente laisse l'air s'échapper par bulles. Cette bougie peut être adaptée à des appareils variés. On peut par exemple la fixer au moyen d'un bouchon dans le col d'un ballon portant une tubulure latérale et un tube de distribution (fig. 28). Le tout est mis au four et flambé. Pour l'usage, il suffit Fig. 28. d'atteler la tubulure à une trompe, et de mettre le liquide à filtrer dans l'entonnoir pour obtenir dans le ballon un liquide stérile. Lorsqu'il s'agit de filtrer de grandes quantités de liquide, que ce soit de l'eau ou des liquides de culture, on se sert de bougies de plus grande dimension, dont les plus connues, en France au moins, sont les bougies Chamberland. Il en existe deux marques : METHODES DE CULTURE 103 l'une, qui porte la lettre B sur le culot, est très dense et filtre len- tement ; Fautre, marquée F, est plus poreuse et filtre plus vite, Ces bougies portent une embase, munie d'une tôtière. Pour les stériliser, on entoure la têtière de coton, on la coiffe d'un tube de verre qu'on effile en pointe et qu'on ferme à la lampe. Le Fig. 29. tout est mis au four à flamber. On adapte ensuite la bougie, au moyen d'une bague de caoutchouc et d'un anneau métallique, à une armature cylindrique qu'on visse sur un réservoir dans le- quel on met le liquide à filtrer, et où on peut exercer une pression plus ou moins forte au moyen d'une pompe à main. On obtient ainsi des filtrations plus ou moins rapides. Le liquide filtré et stériHsé est reçu, par le tube effilé qui garnit la têtière, dans des 104 CHAPITRE V récipients préalablement stérilisés, fermés par un tampon de co- ton, au travers duquel on enfonce le tube effilé, après l'avoir ou- vert et passé dans la flamme. Tel est, dans son ensemble, ce qu'on appelle le filtre Chamberland. On peut avoir recours à des dispositifs plus simples, relier, par exemple, la bougie au moyen d'un tube de caoutchouc, avec le récipient distributeur, stériliser le tout à l'autoclave à 120". Puis, pour l'usage, on immerg-e la bougie dans le liquide à filtrer, et on produit une aspiration dans le récipient. Ces filtres ne sont pas sans inconvénients. Ils ne laissent pas passer tout ce qui se présente. Ils retiennent certaines albumi- nes, la totalité de celles qui sont non en solution, mais en suspen- sion, les diastases, certaines matières colorantes, des toxines, etc. Le liquide filtré n'est donc que rarement identique au liquide non filtré. Par contre, la filtra tion est le seul moyen de stériliser certaines substances particulièrement altérables à la chaleur. Pour la filtration des eaux potables, la bougie filtrante peut rendre de grands services, et nous la retrouverons en étudiant cette question d'hyg-iène. *74. Liquides de culture. — Les liquides de culture employés en bactériologie sont innombrables. Chaque espèce microbienne a le sien, et doit avoir le sien, car un des caractères de ces êtres, MÉTHODE l)K CULTURE 105 c'est précisément qu'ils sont très difficiles sur leurs conditions d'alimention, et ne s'accommodent en général que d'un aliment déterminé. Mais ils n'ont pasbesoin d'en trouver beaucoup, et en prenant des liquides complexes, comme du bouillon de viande, de la pcptone,des jus de fruits ou des infusions végétales, en les additionnant ou non de sucre ou d'autres substances, on réussit à en faire des milieux nutritifs généraux pouvant servira la cul- ture d'un grand nombre de microbeî^, et d'un emploi fréquent dans les laboratoires. Ce sont les seuls que nous décrirons ici. Ils se divisent en milieux liquides et milieux solides. MILIEUX LIQUIDES 48. Bouillon. — On obtient un bouillon d'infusion en laissant pendant 24 beures, en contact avec deux fois son poids d'eau, de la viande de veau aussi maigre que possible et finement ha- chée. On décante, on presse le résidu, on cuit une heure le liquide décanté et exprimé, et onfîltre.On ajoute alors 1 0/0 de peptone, O^o 0/0 de sel marin, et assez de solution de soude pour ramener à la neutralité le liquide, qui est en général un peu acide. On fait cuire à nouveau, on filtre, on répartit dans les vases de cul- ture et on stérilise à l'autoclave. Le bouillon par décoction s'ob- tient de même en faisant bouillir le liquide avant de l'avoir séparé de la viande en contact. En forçant la solution de peptone, on améliore souvent le milieu, surtout pour un certain nombre de bactéries pathogènes habituées à vivre dans les tissus. Mais en mettant de la peptone, on ne sait pas ce qu'on met, car d'abord ce n'est pas un corps défini, puis les fabricants la mélangent souvent avec des matières étrangères. Il y a donc une question de marque qui intervient, et encore chaque marque n'est pas tou- jours identique à elle-même. 49. Lait. — Le lait échappe à ces variations et à ces incertitu- des. Il faut seulement le prendre aussi débarrassé que possible de sa matière grasse, et pour cela se servir de lait centrifugé, ou, si on en est réduit au lait ordinaire, lui accorder 24 heures de repos dans un endroit frais. On siphonne le liquide au-dessous de la couche de crème, et on le stérilise à 120" en insistant plus qu'avec le bouillon, car il y a souvent, dans le lait, des spores 106 CHAPITRE V très résistantes. S'il est un peu acide au moment de l'emploi, il risque de se coaguler dans l'autoclave. Il faut donc le ramener à la neutralité avec quelques gouttes d'une solution de soude, et ne pas dépasser ce point, sous peine de voir le lait noircir par chauffage, à la suite de l'attaque du sucre de lait par l'alcali sura- jouté. 50. Fetit lait. — Le sérum retiré du lait par coagulation con- tient encore de la caséine soluble, du sucre et des sels. Il peut être o])teuu très transparent par fîltration, et constitue un bon milieu nutritif pour quelques espèces. On coagule le lait à chaud par un acide, on filtre au papier ; on ramène la neutralité par un peu de solution de soude et on fait bouillir. Il se fait un collage qui clarifie. Mais, en même temps, il y a réapparition d'un peu d'acidité, par ce qu'il s'est précipité du phosphate tribasique de chaux qui a entraîné un peu de la chaux du phosphate bibasique, neutre au tournesol, existant dans le lait. Il faut donc saturer à nouveau. On passe alors à la bougie filtrante, ou bien on fait bouillir, on filtre pour séparer le précipité qui se forme, et on sté- rilise à l'autoclave. Dans ce liquide certains bacilles produisent des acides, tandis que d'autres, très voisins, le laissent neutre. Ainsi le bacille typhique et le h. coll. Petruchsky a proposé, pour rendre les différences plus nettes, d'ajouter au milieu un peu de tournesol. 5 1 . Eau de levure . — On prend de la le vure de brasserie , et non des levures de commerce, souvent additionnées de fécule, et qui, à raison de ce fait, ne donnent pas des décoctions limpides. On met cette levure en suspension dans l'eau, et on lapasse au tra- vers d'un tamis de soie à mailles serrées, pour la débarrasser de ses plus grosses impuretés. On laisse reposer quelques minutes le liquide tamisé : on le décante ensuite pour le séparer des pous- sières fines plus lourdes qui 'ont traversé le tamis, et on l'aban- donne pendant 24 heures à lui-même. La levure se sépare, lais- sant au-dessus d'elle un liquide de lavage trouble, qu'on jette. On délaye le dépôt dans l'eau, à raison de 40 à 50 grammes de de levure humide par litre, et on fait bouillir en agitant constam- ment avec une spatule. Quand le liquide bout, on le jette sur un filtre. La décoction est limpide quand lalevure est fraîche. Quand METHODES DE CULTURE 407 elle est un peu louche, on réussit d'ordinaire à l'éclaircir en y déterminant un léger précipité de phosphate de chaux, au moyen de quelques gouttes d'une solution d'acide phosphorique qu'on sature ensuite avec de l'eau de chaux. La liqueur ainsi traitée de- vient neutre, tandis qu'elle est légèrement acide quand elle pro- vient d'une simple décoction. 52. Eau de touraillon. — On prépare, avec les radicules de l'orge germé, séchées dans l'opération du touraillage, une décoc- tion qui, provenant des tissus d'une jeune plante, est très nutritive pour certaines espèces microbiennes. Pour l'obtenir limpide, il faut seulement laver d'abord les touraillonsà grande eau, de façon à les débarrasser de la poussière de farine dont ils sont en géné- ral couverts. Pour dissoudre les dernières parties d'amidon, on ajoute une petite quantité de malt broyé, et on fait macérer le tout pendant une heure au voisinage de 60°. Puis on fait bouillir et on jette sur un filtre. Ce liquide est pauvre eu azote. On l'améliore en y ajoutant un peu de peptone. 53. Eau de navets, de foin, etc. — Les navets sont coupés en tranches, le foin est débité en paillettes après lavage. Une courte ébullition donne un liquide limpide, neutre avec le navet, un peu acide avec le foin vert, neutre si le foin est vieux, alcalin même s'il est sale. 54. Urine. — Certains microbes ont Turine comme terrain naturel de culture : tels, par exemple, les ferments de l'urée. Il faut tenir compte de ce que ce liquide se trouble quelquefois, à l'ébullition, et peut même devenir un peu alcalin par suite de l'hydratation de l'urée. On le fera donc bouiUir, et on le filtrera à chaud avant de le répartir dans les ballons où il devra être stérilisé. MILIEUX SOLIDES Les milieux solides comprennent les tranches de fruits, pommes de terre, betteraves etc., dont on fait des jardins de culture, et aussi les milieux gélatinisés vulgarisés par Koch, et qui ont rendu tant de services à la science. 108 CHAPITRE V 55. Culture sur pomme de terre. — On découpe dans une pomme de terre, soit au moyen d'un couteau, soit au moyen d'un emporte-pièce spécial, des tranches ayant la forme d'un demi- cylindre, qu'on introduit dans des tubes à essai un peu larges. Ces tubes (fig-. 31) portent vers leur quart inférieur un étranglement qui sert de support au frag-mcnt. Dans la partie inférieure se ras- semljlera le liquide qui sort de la pomme de terre après la cuisson. Fig. 31, Il n'est pas nécessaire que le tube soit stérilisé à l'avcUice. On le ferme avec un tampon de coton, et on le chauffe à 115" dans l'au- toclave, en maintenant cette température pendant un quart d'heure. Les tranches doivent être assez épaisses pour ne pas s'affaisser après la cuisson. A la sortie de l'autoclave, la surface du fragment de pomme de terre est un peu humide ; il suffit de placer verticalement le tube à l'étuvc pendant quelques heures pour que 1 eau s'égoutte et que la surface s'assèche. Elle est alors prête pourl'enqîloi. Cette méthode, proposée par Roux, est main- tenant adoptée dans tous les laboratoires. MÉTHODES DE CULTURE 109 56. Milieux à la gélatine. — L'emploi des milieux gélatini- sés, proposé pour la première fois pai- Brefeld, a été régularisé et généralisé par Koch,qui en a montré tous les avantages. En empêchant les microbes mobiles de se déplacer, et ceux qui ne le sont pas d'être déplacés par les mouvements du liquide, le milieu à la gélatine force chaque germe à se développer sur place et à y former une colonie, bientôt visible à l'œil nu, dont la forme, la couleur, la croissance superficielle ou profonde, l'action sur la gélatine sont autant de caractères bons à consulter, et dont quel- ques-uns même, dans des circonstances données, peuvent devenir différentiels. Les mycéliums, dont la croissanceest en général sur- tout terminale, y forment des arborescences variées à ramuscules à peu près rectilig-nes. Les bacilles, qui poussent, comme nous l'a- vons vu, sur toute leur longueur, doivent, à raison des résis- tances qu'ils rencontrent à leurs extrémités, se courber en arc, et donner, surtout lorsqu'ils sont gros, des arborisations à ramus- cules courbes ou des enchevêtrements parfois très compUqués. Les coccus et les levures, à raison de leur forme et de leur mode de multiplication, donnent de préférence des colonies denses et à contours réguliers. L'obstacle principal à la croissance de ces colonies est que la nourriture ne peut leur arriver que peu à peu, par voie de diffu- sion : elle est rapidement épuisée autour de la jeune colonie, et doit ensuite venir de plus en plus loin, lorsque la gélatine elle- même n'est pas un aliment, comme tel paraît être le cas pour beaucoup de microbes. Seuls les bacilles du choléra et quelques autres la creusent en entonnoir et la font disparaître. Pour éviter cet inconvénient de la famine, dans la mesure du possible, il faut que les milieux à la gélatine soient très nutritifs. Pour préparer la gélatine au bouillon, la plus usitée, on fait une macération de viande maigre et hachée dans deux fois son poids d'eau, comme nous l'avons dit plus haut(48),etonpasse àla presse après 8 à 12 heures. A cette macération, on ajoute, par litre, 100 gr. de gélatine, 10 gr. de peptone, o gr. de sel marin, et on chauffe lentement au bain-marie, en ne dépassant pas 60°. Ouand tout est dissous, on alcalinise avec une solution concen- trée de soude à 10 0, mais sans excès : la gélatine, chauffée en milieu trop alcalin, est attaquée, et ne fait plus prise en se refroidissant. ilO CHAPITRE V On chaufie ensuite à 100" pendant 1 heure, à l'autoclave ou au stérilisateur à 100°. Les matières qu'a respectées le premier chauffage à 100° se séparent, avec des phosphates, du milieu devenu alcalin, et il se fait un collage, de sorte que si on jette sur un filtre à filtrations chaudes, on obtient en général un liquide limpide. Quand il ne l'est pas, on le laisse refroidir vers 55°, et on y jette un blanc d'oeuf étendu de 5 ou 6 fois son volume d'eau. On chauffe de nouveau à 100" et on filtre. Les parois de l'entonnoir doivent être maintenus à 100° par un bain d'eau ou de vapeur. En employant du papier Chardin, on a une filtration très rapide à cette température. Le liquide filtré est ensuite réparti dans les vases de culture, préalablement stérilisés à 180°. Ceci est encore plus essentiel que pour le bouillon, avec lequel la stérilisation à l'autoclave pourrait suffire à la rigueur pour stériliser aussi le vase. Ici, on ne peut pas chauffera llo'^ la gélatine sans l'altérer. Il faudra donc employer la méthode de Tyndall, qui serait sans action sur les germes déposés sur les parois du vase de culture. 5*7 . Milieux sur gélose. — La gélatine se liquéfie et perdions ses avantages à des températures inférieures à celles que pré- fèrent certains microbes, surtout certains microbes pathogènes. Elle ne peut même pas être employée pendant les fortes chaleurs de l'été. On la remplace alors par une algue de la famille des Floridées, très commune dans les mers du Japon. Payen, qui l'a étudiée, a montré qu'elle était surtout formée d'une substance de nature cellulosique, liquide à chaud, se prenant en gelée par refroidissement comme la gélatine, mais ayant sur elle, pour l'objet que nous avons en vue, deux avantages principaux. En premier lieu, le pouvoir gélifiant de cette substance, qu'après Payen nous appellerons gélose, est dix fois plus grand environ que celui de lagélatme.En second lieu, la gélose est une espèce de cellulose que peu de microbes peuvent attaquer, tandis qu'il y en a beaucoup qui liquéfient la gélatine pour s'en faire un ali- ment. On peut en outre, avec quelques précautions, faire des géloses aussi transparentes que des gélatines. Pour cela, à la macération de viande que nous avons appris à préparer plus haut, on ajoute, par litre, 10 gr. de peptone et 5 gr. de sel. Puis on chauffe une heure à 100° à feu nu, et on MÉTHODES DE CULTURE 111 filtre sur papier mouillé, pour retenir les graisses. On alcalinise alors avec une dissolution de soude à 2 0/0, en n'oubliant pas que si la gélatine est attaquée à chaud en milieu alcalin, la gélose l'est, au contraire, en milieu acide, où elle se transforme en sucre. Il faut donc alcaliniser le milieu avant d'y ajouter 15 gr. de gélose coupée en petits fragments. Puis on porte lentement à l'ébullition, en agitant constamment, pour éviter que la gélose ne se colle contre les parois. Quand elle est dissoute, on passe au tamis. On laisse refroidir ;\ 55", ou ajoute un blanc d'œuf délayé dans 50 ce. d'eau, et on chauffe à l'autoclave, à 120", pendant 3/4 d'heure. La gélose en sort collée et limpide. On la fdtre au travers d'un filtre à filtrations chaudes, sur du papier Chardin. On la reçoit au sortir du filtre dans un ballon maintenu dans l'eau bouillante, qui sert à la répartir dans les matras de culture. Ceux-ci sont une dernière fois" stérilisés à 115" ou 120". Cette gélose adhère beaucoup moins au verre que la gélatine ; elle fond, en outre, à une température plus élevée, trop élevée pour qu'on puisse y faire des ensemencements : elle présente heureusement le phénomène de la surfusion. Liquéfiée à 70" environ, elle ne se gélifie à nouveau que vers 40°-45", et très lentement. On peut à ce moment y ensemencer des microbes dans toute la masse sans risquer de les tuer, à moins qu'ils ne soient très sensibles. On peut aussi, à cette même température, acidifier la gélose en y ajoutant un peu d'acide lactique stérilisé, et avoir ainsi des milieux acides à la gélose qu'il serait impos- sible d'obtenir autrement, la^ gélose ne supportant pas, comme nous l'avons vu, le chaufiage en milieu acide. 58. Sérum. — Le sérum liquide est un médiocre terrain de culture pour la plupart des microbes. Quand il a été coagulé par un chaufiage à 70", il devient un milieu de choix pour certaines espèces, par exemple pour le microbe de la diphtérie. Pour s'en procurer, on apporte à l'abattoir des vases cylin- driques à couvercle qu'on a stérilisés au four à flamber, après les avoir enveloppés de papier. On y recueille, en soulevant légè- rement le couvercle, le sang d'une saignée, en perdant les pre- miers jets. Quand le vase est à moitié plein, on laisse retomber le couvercle, et on porte le tout, dans l'abattoir même, dans un endroit frais. Après 24 heures, si les vases étaient tout à fait 112 CHAPITRE V propres, on trouve un caillot rétracté, nageant au milieu d'un liquide citrin, qu'on recueille par aspiration, et qu'on distribue dans des ballons stérilisés. (]eux ci sont rapportés au labora- toire, fermés à la lampe et stérilisés à basse température, par une heure de chauffage par jour, pendant quinze jours, dans un bain-marie où le ballon est immergé, et où un régulateur em- pêche la température de s'élever au delà de 58". C'est de ces ballons qu'on retire ensuite le sérum stérilisé pour le répartir dans les matras à culture ; il ne reste plus qu'à le coaguler en le chauffant à 70" dans un bain-marie. Lorsqu'on dépasse cette limite ou qu'on la maintient trop longtemps, le sérum devient absolument opaque. Coagulé avec ménagement, il garde une transparence parfaite : au fond des tubes il reste toujours un peu de liquide non coagulé. On peut, avec des soins dans la prise du sang, en faisant la ponction avec un trocart stérilisé^ en recevant le sang, par un caoutchoac stérilisé, dans un vase stérilisé, retirer de la jugulaire d'un cheval un sérum tout à fait aseptique. C'est ainsi qu'on pro- cède pour la récolte des sérums thérapeutiques, auxquels le moindre chauflage enlèverait quelques-unes de leurs qualités. Un sérum ainsi recueilli peut être coagulé de suite, dès qu'il est séparé du caillot. VASES DE CULTURE 59. Cultures aérobies. — La forme des vases de culture est différente suivant qu'il s'agit de microbes aérobics ou de microbes anaérobies. Pour les premiers, on se contentera de boucher avec des tam- pons de coton les vases qui les contiennent, et dont la forme peut, du reste, être très variable suivant qu'on veut assurer plus ou moins l'accès de l'air. L'une des plus commodes est le ma- tras Pasteur, (fig. 32) dont le bouchon, rodé à l'émeri, est à recou- vrement, de sorte que le goulot du matras n'est jamais souillé jDar la poussière. Le capuchon est muni d'un tube obstrue par un tampon de coton, qui permet à l'air pur d'entrer et de sortir libre- ment. Ce tube est trop étroit pour assurer une aération parfaite quand la vie dans le matras est un peu active, et on a avantage alors à se servir d'un simple tube à essai bouché au coton, qu'on METHODES DE CULTURE 113 incline plus ou moins suivant qu'on veut donner au liquide de culture une surface plus ou moins grande relativement à son volume. Quand on veut être encore plus assuré du renouvelle- Fiff. 32. ment de l'air^ on prend le matras Fernbach (fig-. 33), muni de trois tubulures fermées au coton ; les deux opposées permettent de renouveler constamment l'air. Il faut seulement avoir soin de faire barboter, dans de Teau à la température de l'étuve, Fiff. 33. Tair qu'on appelle au moyen d'une trompe, de façon à ce qu'il ne dessèche pas le bouillon de culture. L'ensemencement se fait au moyen d'un fil de platine recourbé en anse ou en œillet à son extrémité libre, et implanté par l'autre 114 CHAPITRE V dans une tige de verre qu'on a pour cela ramollie au feu. On flambe le fil avant de s'en servir, on le plonge dans la culture qui sert de semence^ contenue par exemple dans un matras Pas- teur, on flambe le capuchon; on le remet sur le matras. On ouvre le matras à ensemencer et on y plonge le fil de platine, avec la petite quantité de liquide qu'il porte à son extrémité. Cette quantité est à très peu près constante pour un même liquide, et ne dépend «tlors que de la forme et de la dimension de la boucle. Par contre, elle varie d'un liquide à l'autre, car elle dépend de ses propriétés capillaires. Elle est toujours très petite, et ne dépasse guère 1/40 de cent. cube. Quand on veut ensemencer plus copieusement, il faut se servir d'une pipette effi- lée fermée par un tampon de coton, et flambée ; on en casse l'ex- trémité entre les doigts, on la passe dans la flamme, on y aspire quelques gouttes du liquide de semence, qu'on introduit dans le ballon à ensemencer. Il faut se rappeler qu'on ensemence tou- jours trop, surtout quand on débute dans ces études. Les milieux solides, convenablement ensemencés, permettent de résoudre plusieurs problèmes. eo. Ensemencement par piqûre. — Après avoir plongé dans une culture un fil de platine droit, emmanché dans une tige de verre, on prend un tube à essai contenant de la gélatine nutri- tive, on le débouche en tournant l'orifice vers le sol, et on en coifle le fil de platine tenu verticalement, de façon que ce fil vienne toucher le centre de la gélatine. On abandonne le tube, qui s'enfonce par son propre poids. Puis, quand le fil a touché le fond, on le laisse ressortir en abandonnant la baguette à elle- même ; on obtient ainsi un ensemencement en profondeur. On flambe les bords du tube, et on remet le bouchon de ouate. Si l'être ensemencé est surtout aérobie, il se développe dans les couches superficielles; s'il préfère la vie anaérobie, il se déve- loppe plus vite dans les profondeurs, où l'oxygène est plus dif- ficile à remplacer. 61. Ensemencement par stries. — Onpeut,pourles microbes aérobies, prendre un tube de gélatine qu'on a presque couché pour le laisser refroidir, de sorte que la surface de la gélatine est en bec de flûte. Sur cette surface, avec la pointe du fil de METHODES DE CULTURE 113 platine recourbée à angle droit, on trace une ou plusieurs stries superficielles parallèles au grand axe de l'ellipse. On peut de même, et sur le même milieu, faire, à côté l'une deFautre, deux stries de deux êtres qu'on veut comparer, écarter plus ou moins ces stries ou les faire chevaucher l'une sur l'autre pour savoir comment ces deux êtres se partagent la nourriture ou s'influen- cent l'un l'autre. Mais il faut pour cela qu'aucun d'eux ne hquéfie la gélatine. 6S. Numération des colonies. — Si on fait l'ensemencement dans la gélatine pendant qu'elle est encore liquide, si on agite pour y répartir uniformément les germes, et si on laisse refroidir ensuite, chaque germe, s'ils sont bien séparés, deviendra l'ori- gine d'une colonie visible à l'œil nu, ce qui en rend la numéra- tion possible. Mais pour faire cette opération sans laisser trop de place aux cause d'erreur, il faut prendre quelques précautions que nous allons décrire. On commence par préparer les vases de culture. Ce sont de préférence des boites plates, dites boîtes de Pétri, (fig. 34) for- Fig. 34. mées de deux petits cristallisoirs qui entrent l'un dans l'autre sans frottement. On les stérilise en les pliant dans du papier, et en portant le tout au four à flamber. Il faut que le papier jaunisse un peu, mais ne se carbonise pas. On liquéfie d'un autre c6té, dans un bain-marie chauffé à 30-35", ou plus simplement en la tenant dans sa main, la gélatine contenue dans des tubes à essai, et lorsqu'elle est bien liquide, on prend à l'aide d'un fil de platine une gouttelette de culture, et on l'y introduit. On rebouche le tube, on flambe le coton et les bords de l'orifice, on stérilise l'aiguille, puis on fait rouler rapidement le tube entre les paumes des deux mains, en le tenant bien vertical, de façon à bien mé- langer ce qu'il contient sans y former de bulles d'air. Ce premier tube contient beaucoup de microbes, pour peu que 416 CHAPITRE V la gouttelette de liquide qu'y a apportée le fil de platine en soit chargée. Les colonies, en se développant, seraient trop serrées, et outre qu'elles pourraient se nuire par leur rapprochement, elles seraient très difficiles à compter. Il y a le plus souvent avantage à faire une nouvelle dilution, en opérant avec le pre- mier tube ensemencé comme on l'a fait avec la culture ori- ginelle. Parfois même, il sera utile d'en faire une 3% une 4*^ dilution. Si on connaît à chaque fois le volume du liquide em- ployé, le calcul de la dilution finale est facile. Toutes ces dilutions sont coulées séparément chacune dans une boite de Pétri. Pour cela on prend le tube, on le débouche en l'inclinant, on flambe l'orifice en le passant dans la flamme, et soulevant de l'autre main le couvercle de la boite de Pétri, on y étale la gélatine, et on referme le couvercle. Le tube est refermé à son tour avec son tampon de coton, et couché hori- zontalement : on étale, en inclinant la boite, la gélatine sur le fond, et on la place sur un corps froid, ou même sur de la glace, pour hâter la prise de la gélatine. On retourne aussi le tube pen- dant son refroidissement pour étaler sur la paroi ce qui y reste de gélatine, et quand le milieu de culture est redevenu solide, on met à l'étuve entre 15 ou 20". La numération des colonies se fait à l'œil nu, ou avec un oculaire quadrillé, dans la dilution où elles sont un peu serrées, sans l'être trop, et on peut ainsi avoir une idée du nombre d'êtres vivants dans la gouttelette de culture ensemencée à l'origine. On peut même, en examinant, soit à l'œil, soit à un faible grossissement, les colonies développées dans la boite de Pétri, voir si elles se ressemblent, et peuvent être considérées comme appartenant à une même espèce, ou si elles diffèrent, et si par conséquent la culture qui les a fournies était impure. Au lieu d'étaler la gélatine dans une boite de Pétri, on peut l'enrouler sur la paroi intérieure du tube à essai en refroidissant celui-ci, soit au contact de l'eau, soit au contact d'un bloc de glace, et en le tenant presque horizontal pendant qu'on le fait rou- ler aussi uniformément que possible autour de son axe. On obtient alors un manchon de gélatine : c'est ce qu'on appelle un tube roulé d'Esmarch. Cette méthode est loin de valoir celle des boîtes. L'étude individuelle et la numération des colonies y sont plus difficiles. MÉTHODES DE CULTURE 117 63. Cultures en gouttes pendantes. — Quand on veut pou- voir suivre de près, non pas seulement à la loupe, comme avec les boites de P(5tri, mais avec le microscope, le développement des membres d'une colonie, on peut employer une autre méthode. Sur une lamelle de verre bien propre, on dépose, soit au moyen de l'anse de platine, soit au moyen d'une pipette, une gouttelette de liquide de culture faiblement chargée de germes. Puis on retourne la lamelle sur un anneau de verre porté par la lame, ou sur une cavité qui y est creusée : pour éviter l'évapora- tion, on place le tout, dans l'intervalle des observations, sous une cloche à parois humides. En examinant au microscope les bords de la goutte, on trouve facilement des champs de développe- ment qu'on peut fouiller dans toute leur épaisseur, qui est faible en ces points. La chose est encore plus facile quand la goutte- lette est faite avec du bouillon gélatine transparent. Quand elle contient peu de colonies, on peut étudier toutes celles qui sont comprises dans une épaisseur à peu près égale à la distance frontale de l'objectif. CULTURE DES MICROBES ANAEROBIES 64. Cultures à l'abri de l'air. — Les cultures à l'abri de l'air exigent un matériel un peu plus compliqué que les cultures aérobies. Aussi sont-elles d'ordinaire plus négligées. Elles peu- vent pourtant rendre de nombreux services, et il y a des cas où on ne peut pas s'en passer, par exemple, lorsque le mi- crobe à cultiver ne peut pousser que tout à fait à l'abri de l'air, ou dans un gaz inerte, comme le premier microbe pathogène anaérobie découvert par MM. Pasteur, Joubert et Chamberland, et appelé par eux vibrion septiqiie. L'appareil dont ils se sont servis pour le cultiver consiste dans un tube à deux bran- ches, T (fîg. 35), auquel est soudé un tube de yerre étranglé en A et pourvu d'un petit tampon de coton. Chacune des bran- ches porte latéralement un petit tube effdé d. Le tube est ainsi stérilisé dans le four à flamber. Dans une des branches on fait entrer le liquide nutritif pur et préalablement ensemencé, en plongeant l'effdure ouverte dans le tube qui la contient et en aspirant par le tube A, puis on ferme l'effîlure à la lampe, et on aspire de même dans la seconde branche le bouillon de cul- H8 CHAPITRE V ture non ensemencé. Le tube A est ensuite relié k une machine pneumatique à mercure et on fait le vide. Au moyen d'une TROMPE^ Fig. 35. petite flamme de gaz. appliquée avec précaution, on détermine l'ébullition, à basse température, du liquide dans les deux branches pour bien chasser tout l'air. Les bulles produites viennent crever sur la paroi du tube légèrement chauffée dans sa partie supérieure : les projections d'une branche dans l'autre sont ainsi évitées. Avec un jet de gaz, on sépare le tube de la machine en fondant le verre en A, dans la partie étranglée. L'appareil est porté à l'étuve, le développement se fait dans la branche ensemencée, le liquide restant limpide dans l'autre branche, si on a bien opéré. Pour avoir une seconde culture, il suffît d'incliner le tube de façon qu'une trace de la culture passe dans la branche non ensemencée. La pompe à mercure peut être remplacée par une trompe à eau ; toutefois, comme cette trompe ne donne pas un vide aussi complet que la pompe à mercure, il faut remplir le tube d'un gaz inerte et le vider à plusieurs reprises. Le tube sera donc ratta- ché par un caoutchouc épais à un tube en T qui communique MÉTHODES DE CULTURE 119 par sa branche F avec la trompe, et par sa branche E, avec un gazomètre contenant de l'acide carbonique ou de Thydrogène parfaitement privé d'air. Les deux branches F et E portent cha- cune un robinet. Lorsque le vide est fait, on ferme le robinet F et on ouvre le robinet E : le gaz pénètre du gazomètre dans le tube ; le robinet E est alors fermé et la communication avec la trompe est rétablie en ouvrant le robinet F. Cette manœuvre répétée deux ou trois fois suffit à enlever complètement à la fin l'air de l'appareil. On peut vider le tube ou le laisser rempli du gaz privé d'oxygène. Le même gazomètre peut être facilement relié à la pompe à mercure. Les organismes anaérobies donnent lieu à un dégagement de gaz qu'il est parfois intéressant d'étudier. Il sera facile de retirer ce gaz de l'appareil que nous venons de décrire, au moyen de la pompe ou de la trompe à mercure. Pour faire une prise du liquide contenu dans l'intérieur du tube sans introduire d'impua^eté dans la culture, il faut casser le tube effilé A au-dessus du coton, laisser rentrer l'air, et incliner le tube pour faire sortir un peu du liquide par l'effilure latérale préalablement ouverte et passée dans la flamme. L'introduc- tion de l'air arrête la culture. Si on veut qu'elle continue, il faut ouvrir le tube de façon qu'il se remplisse d'un gaz inerte. Pour cela, après avoir fait un trait à l'extrémité du tube A, on l'adapte à un tube de caoutchouc relié au gazomètre, on casse la pointe dans le tube de caoutchouc et le gaz remplit l'appareil. La culture en milieux solides n'exige pas des appareils plus compliqués. On étire un tube de verre en lui donnant la forme figurée dans la figure 36 ; l'extrémité supérieure est fermée par un tampon de coton, et tout le tube est fortement chauffé dans la lampe à alcool. Pendant qu'il est encore chaud, on plonge son extrémité effilée dans un tube de gélatine que l'on vient de faire bouillir, on aspire en A, la gélatine bouillante monte dans le tube : quand elle est arrivée en b, on retire vivement le tube en l'inclinant de façon que la gélatine ne puisse sortir par l'orifice inférieur que l'on ferme aussitôt à la lampe. Le tube redressé est fermé par un trait de chalumeau dans sa partie étranglée, un peu au-dessus de la gélatine. Après qu'il sera refroidi, le tube pourra être ensemencé par piqûre à la manière ordinaire : il suf- 120 CHAPITRE V fit d'ouvrir l'extrémité supérieure effilée et de la refermer à la lampe, Tensemencement terminé. Dans ces petits tubes, qui sont très faciles à préparer, le gaz produit par la vie de l'orga- nisme ne peut se dégager, et disloque la culture. Il faudra donc ouvrir d'abord le tube par le bout opposé à celui par lequel on / Fig. 36. Fig. 37. a introduit la semence, sans quoi une partie de la culture pourrait être projetée au dehors. Comme l'ébuUition ne chasse pas com- plètement l'air dissous, il y a parfois de la lenteur dans le déve- loppement. Le dispositif suivant (fig. 37) évite ces inconvénients. La gélatine nutritive est contenue dans un tube à essai, étiré à sa partie supérieure en un tube assez mince pour qu'il soit facile- ment fermé au chalumeau, et fermé par un tampon de coton. Lorsque la gélatine a été liquéfiée dans un bain d'eau chaude, on fait pénétrer par l'orifice supérieur un tube de petit calil^re qui ne ferme pas complètement l'ouverture, et qui amène un courant de gaz inerte privé d'air. Le tube adducteur du gaz a été soi- gneusement stérilisé, et il porte un tampon de coton a qui arrête les impuretés que pourrait entraîner le courant gazeux. L'appa- MÉTHODES DE CULTURE 121 reil ost ainsi promptement privé d'air. On soulève alors le tube adducteur au-dessus du niveau de la gélatine, qu'on rend solide en la refroidissant. Le courant de gaz continue d'empêcher l'intro- duction de l'air extérieur ; en soulevant le coton qui ferme l'ori- fice du tube T, on introduit un fd de platine chargé de la semence, on pratique la piqûre dans la gélatine. Le tube adducteur est alors soulevé jusque dans le haut du tube T, que l'on ferme à l'étranglement, avec le chalumeau. On évite ainsi complètement l'introduction de l'air. Au lieu de chasser l'air par un gaz inerte^, on peut faire le vide avec la trompe, comme nous l'avons décrit pour les cultu- res dans les milieux liquides. Pour cela, il est avantageux d'em- ployer le tube (fig. 38). Il contient de la gélatine nutritive stéri- lisée à la façon ordinaire. La tubulure A communique avec la machine à faire le vide, elle est étirée en b de façon à pouvoir être facilement fermée avec une flamme de gaz, et elle porte en c un tampon de coton. La tubulure B est fermée au chalumeau. Fis;. 38. La gélatine est fondue à une température aussi basse que possi- ble ; à deux ou trois reprises on rince l'appareil avec le gaz inerte du gazomètre, ainsi que nous l'avons expliqué plus haut. Les projections de la gélatine sont facilement évitées, soit en chauf- fant avec une légère flamme la paroi du tube dans la partie supé- rieure, soit en laissant rentrer le gaz inerte si l'ébullition devient turnultueuse : c'est là un jeu de robinets facile à comprendre. 122 CHAPITRE V L'appareil étant privé d'air, on le laisse refroidir en le mainte- nant en communication avec le gazomètre. Lorsque la gélatine a fait prise, on soulève le flacon à eau du gazomètre de façon à produire une légère pression dans l'intérieur du tube. Avec un Fig. 39. couteau à couper le verre, on fait un trait sur la portion effdce, «, et après l'avoir chaufîee, on la casse en a avec une pince flambée ; le gaz s'échappe, empêchant l'introduction de l'air : par l'orifice on fait pénétrer le fil de platine ou une tige de verre avec laquelle on fait la piqûre. Il est facile de conserverie tube plein de gaz, ou de le vider si l'on veut ensuite étudier le gaz que dégagera la culture de l'organisme anaérobie. L'appareil est dé- taché par un trait de chalumeau sur la partie étranglée ô, 65. Colonies en cultures anaérobies. — Le dispositif suivant permet la séparation des colonies et la récolte de la semence dans les colonies isolées. Il se compose d'un tube de verre fermé, large de 3 centimètres environ, long de 25 à 30 centimètres, et terminé par un tube plus étroit, obturé par un tampon de coton. Ce tube (fig. 39) contient un peu de g'élatine stérilisée ; on fond la gélatine et on introduit, avec les précautions ordinaires, une METHODES DE CULTURE 123 quantité de semence convenal)le pour avoir des colonies sépa- rées. En ensemençant plusieurs tulies avec des quantités de se- mence de plus en plus petites, on arrive toujours à une sépara- tion parfaite des colonies. On étrangle le tube à la lampe, un peu au-dessus de la partie renflée, en c. On pousse le coton obtura- teur jusqu'à cet étranglement, et on étire le tube en A. L'appa- reil ainsi disposé est mis en communication avec la machine à vide, et il est purgé d'air comme nous l'avons déjà expliqué. On le sépare en fondant au chalumeau en A, et on le couche sur un plan horizontal. La gélatine s'étale sur la paroi inférieure. Elle fait prise, et comme la couche est très mince, on pourra exami- ne* à travers la paroi du verre la forme des colonies. Pour pui- ser dans l'une d'elles, on ouvre la pointe effilée, on fait rentrer de l'air ou du gaz inerte {qui est filtré sur le coton C, on coupe le Fis. 40. verre en e, et avec un long fil de platine ou une tige de verre un peu recourbée à l'extrémité, on peut atteindre la colonie que l'on veut ensemencer. Si les microbes liquéfient la gélatine et que l'on ne puisse pas renverser le tube pour l'examen au mi- croscope, on fait en d un trait avec un couteau à verre, puis, avec un charbon de Berzélius, on complète la section du tube. Par l'ouverture on pourra introduire un diamant monté sur une tige rigide, et faire un trait intérieur sur chaque paroi du tube ; on détachera facilement la gouttière supérieure, et la gouttière inférieure pourra être examinée sous le microscope à la façon d'une plaque ordinaire. 424 CHAPITRE V On peut éviter l'emploi crime machine aspirante, et chasser l'air du tuhe par un courant de gaz inerte. Pour cela, le tube de la figure 40 est d'un usage commode. Le courantde gaz pénètre par le tube latéral qui porte en T un tampon de coton ô, il bar- hotte dans la gélatine maintenue liquide et sort à travers le coton en c. Lorsque l'appareil est bien purgé d'air, on ferme à la lampe en a et on couche le tube comme il a été dit pour l'ap- pareil précédent. Les gaz inertes à employer sont l'azote, l'hydrogène et l'acide cai'bonique. Selon les cas, il faudra rejeter l'acide carbonique qui 41. Fig. 42. peut avoir une influence sur le développement des microbes. De plus, l'acide carbonique et l'hydrogène étant des produits de la vie des organismes anaérobies, il ne faut i)as les employer si l'on veut ensuite faire une analyse des gaz dégagés par la culture. Dans ce cas, le mieux est de faire exactement le vide dans l'ap- pareil, au moyen de la pompe à mercure, qui servira plus tard à retirer les gaz dégagés par les microbes. MÉTHODES DE CULTURE 125 66. Culture anaérobie sur pomme de terre. — En modi- fiant légèrement les dispositifs décrits [)lus haut, il est facile d'ob- tenir des cultures d'anaérobies sur la pomme de terre. l*our cela on soude au tube à essai, au-dessous de l'étranglement un tube latéral, étiré en «, (fig*. 48), et muni d'un tampon de coton, comme le montre la ligure. Après avoir introduit la tranche de pomme de terre dans le tube, on stérilise le tout à l'autoclave comme il a été dit plus haut (55), puis, quand la surface de la pomme de terre est égouttée, on sème l'organisme anaérobie que l'on veut cultiver, et on ferme à la lampe la partie supérieure du tube comme on le voit (fig, 42). La tubulure latérale est reliée à la pompe à mercure et on fait soig-neusementle vide. La tranche de pomme de terre est maintenue pendant quelques instants sous le vide de la machine pour que l'air qu'elle contient s'échappe, puis, avec un trait de chalumeau porté en «, on détache le tube. Il est facile de suivre à travers la paroi du verre le progrès de la culture. Au lieu de faire le vide, on pourrait, après avoir étiré la partie supérieure du tube, faire passer un courant de g'az privé d'oxy- gène, et fermer ensuite à la lampe le tube en haut et en bas. 6 '7. Etuves à température constante. — Une étuve à tem- pérature constante est une nécessité de premier ordre dans un laboratoire de bactériologie. Certains microbes, comme celui de la tuberculose, ne supportent pas des écarts de température de plus de un degré. Le chautTage au gaz doit être fait avec un ré- gulateur de pression ; mais cela ne suffit pas, il faut qu'il y ait un régulateur commandé par la température de l'étuve elle môme. Il en a été proposé beaucoup. Le plus simple, le plus robuste et le plus précis en même temps est celui que représente la figure 43. Il est formé de deux barres métalliques, l'une en acier, l'autre en zinc, soudées ensemble sur toute leur longueur et recourbées ensuite en forme d'U. Le métal le plus dilatable, le zinc, étant en dehors, toute élé- vation dans la température tendra à rapprocher les branches et tout abaissement les écartera l'une de l'autre. Pour une varia- tion donnée de température, le mouvement des branches de l'U sera d'autant plus étendu que les coefficients de dilatation des deux métaux soudés ensemble seront plus différents ; c'est pour cette raison que l'on a réuni le fer et le zinc. Il faut que les barres 126 CHAPITRE V métalliques soient assez fortes pour rester bien rigides et ne pas se rapprocher d'une façon sensible quand on les serre entre les mains. La réunion de deux métaux de dilatation inégale permet, Fisr. 43. avec des barres de longueur modérée, d'avoir un déplacement assez étendu. On fixe une des branches de façon qu'elle soit immobile, et on ajuste à l'autre une tige qui suit ses mouvements, et va ouvrir ou obstruer, dîuis la petite chambre v en verre, l'arrivée du gaz combustible qui, arrivant par T, s'en va ensuite aux brûleurs. METHODES DE CULTURE 427 Les mouvements dus à la dilatation du régulateur bi-métalliqiie peuvent être amplifiés au moyen de leviers, et on augmente ainsi la sensibilité de l'appareil. Ce régulateur est adapté, dans lafigare43, à une étuve chauffée directement au gaz, modèle Schribaux, dans laquelle les produits de la combustion circulent dans une série de tubes verticaux ran- FU gés sur trois côtés de l'étuve. Ce modèle dépense très peu de gaz, et la température y reste très constante, comme le montre le tracé (fig. 44) au thermomètre enregistreur. La température s'est tenue pendant une semaine à 37", 7 avec une variation de 1/10 de degré. Les encoches du tracé correspondent à l'ouver- ture de la porte de Tétuve. La rapide ascension de la courbe au premier jour, au moment de l'allumage, montre avec quelle rapidité la température s'élève et se fixe au niveau voulu. BIBLIOGRAPHIE Pasteur. Etudes sur la bière, 1870. Brefeld. Methoden zur Untersuchung der Pilze. Verhandl. lème posé dans ses traits généraux. Il est facile de voir qu'il comporte une sorte de contradiction au départ. Il exige NUTRITION MINERALE DES MICROBES 177 qu'on connaisse d'avance le milieu le plus favorable à la vie d'une espèce microscopique, c'est-à-dire qu'on ait résolu à l'avance le problème qu'on se pose. On ne peut arriver à connaître ce milieu que par des tâtonnements méthodiques, dans une série de travaux coordonnés, et en écbafaudant lentement chaque pro- grès sur un progrès déjà fait. C'est surtout une œuvre de pa- tience et de méthode. Supposons qu'elle soit accomplie, et qu'on connaisse les conditions physiques et chimiques de la cul- ture qui donnent, dans un temps donné, la récolte maximum, il faudrait encore, pour assurer la sécurité dans la recherche, que deux milieux types identiques donnent des récoltes de même poids. Or un être vivant n'est pas un précipité chimique, et on n'arrivera jamais à ce résultat. Les deux milieux fourniront des récoltes variant entre une limite supérieure P et une limite inférieure P', qu'on réussira à rapprocher, mais jamais à con- fondre. Dès lors il faudra avoir constamment présente à l'esprit la valeur du rapport P'/P, qui représentera l'erreur possible du procédé. Si, dans un autre essai, nous trouvons que le milieu type donne un poids de culture jo,et le môme milieu, privé d'un de ses éléments, un poids de culture p\ il ne suffira pas, pour conclure cjue l'élément supprimé était utile, de constater que le rapport de ^y à p est plus jjetit c{ue 1 ; il faudra encore qu'il soit plus petit que P'/P, c'est-à-dire que l'erreur possible du procédé. 98. Travail de Raulin. — Toutes ces difficultés ont été sur- montées dans un travail classique de Raulin, qui date de 1870, et qui n'a pas été dépassé depuis. Ce savant est arrivé à obtenir, dans un milieu acidulé ne renfermant que du sucre et des sels minéraux parfaitement purs, des récoltes d'une mucédinée spéciale, sans mélange d'espèces étrangères, et plus abondantes que celles que fournirait, dans les mêmes conditions, le milieu organique le mieux approprié. De plus, ces récoltes sont de poids constant, à 1/20 près de leur valeur. La plante qu'il cultive est Yaspergillus )iiger. Elle est formée, comme toutes les végétations microscopiques, d'un mycélium rameux qui vit dans le liquide où on la sème. De ce mycélium partent (lig. 14), en s'élevant dans l'air, des petites colonnettes cylindriques, plus larges que les filaments de mycélium, et se renflant à leur extrémité en une sorte de capitule rond. Sur ce 12 178 CHAPITRE IX capitule sont implantés, dans des directions radiales, des stc- rigmates portant des files despores noires, sphériques, et impeu hérissées à leur surface. Cet aspergillus pousse très facilement sur du pain mouillé de vinaigre, sur l'eau de levure acidulée, sur les tranches de citron, en général sur les fruits et les liqueurs acides, et, lorsqu'on n'en possède pas de semences, il suffit d'abandonner quelques jours à l'air un de ces miUeux, ou de préférence le liquide minéral que nous allons apprendre à préparer, pour qu'un ensemencement spontané, venant de l'air, le fournisse môle à plusieurs espèces végétales. On reconnaît Y aspergillus à ses fructifications noires ; on le sème alors à nouveau sur un liquide artificiel, et on réus- sit bientôt à l'obtenir pur de tout mélange. Le liquide artificiel composé par M. Raulin, qui fournit les ré- coltes abondantes dont nous parlions tout à l'heure, doit avoir la composition suivante : Eau 1 500gr,00 Sucre candi 70 ,00 Acide tartrique 4 ,00 Nitrate d'ammoniaque 4 ,00 Pliosphate d'ammoniaque ^60 Carbonate de potasse ,60 Carbonate de magnésie ,40 Sulfate d'ammoniaque w ,2o Sulfate de zinc ,07 Sulfate de fer ,07 Silicate de potasse ,07 Ceci est la formule à suivre quand on veut préparer ce liquide artificiel. Quand on veut étudier ce liquide au point de vue de la nature et de la proportion des éléments mis en œuvre par la plante, il est utile d'en envisager la composition sous la forme équivalente que voici : Eau 1 500fc''',00 Sucre candi 70 ,00 Acide tartrique . 10 ,00 Ammoniaque 12 ,00 Acide phosphorique ,00 Acide sulfurique ,2S Acide silicique ,03 Potasse ,40 Nutrition minérale des microIîes liô Magnésie ,'iO Oxyde de zinc ,0i Oxyde de fer ,03 Ce qui donne, avec l'oxygène de l'air mis en œuvre pendant tout le procès végétatif, un total de douze éléments chimiques, nécessaires, comme nous allons le voir, à la nutrition complète de la plante. Outre ces éléments chimiques, il faut encore faire intervenir des éléments physiques. D'abord une température convenable, qui doit être voisine de 37° ; puis un état hygrométrique qui protège le liquide contre une évaporation trop rapide, et la plante contre toute dessiccation. L'expérience montre en effet que, dans l'air sec, la végétation est en retard sur la végétation dans l'air humide, et le poids de la récolte moins constant. Il faut que l'hygromètre à cheveu marque au moins 60" dans l'étuve où l'on cultive la plante, et pour amener l'air chautfé à ce degré de sa- turation, il faut provoquer, par un moyen quelconque, à la partie inférieure de l'étuve, une abondante évaporation. La plante ayant besoin d'oxygène pour vivre, il faut aussi re- nouveler l'air à son voisinage, et la présenter h, l'action de ce gaz sous la plus grande surface possible. De là résultent diverses conséquences. Un vase découvert donnera, toutes choses égales d'ailleurs, des récoltes plus abondantes qu'un vase couvert d'une lame de verre. Mais les différences sont faibles, et comme, d'un autre côté, l'évaporation du liquide est beaucoup plus active dans le vase découvert, et qu'il peut en résulter des causes d'erreur graves, il vaudra toujours mieux, lorsqu'on n'aura qu'un petit nombre d'essais, employer des vases couverts d'une lame de verre, qui arrête l'évaporation, sans trop nuire au renouvellement de l'air. Lorsqu'on aura un grand nombre de cultures, serrées les unes contre les autres, on pourra et même on devra de préférence laisser les vases découverts. Toutefois, comme, dans un vase ainsi couvert, l'oxygène arrive seulement par les bords à la surface de la végétation, et comme ce n'est que par les bords de la couche mycélienne qu'il pourra se dissoudre dans le liquide, on se mettra dans des conditions d'autant meilleures que le rapport du périmètre à la surface du vase sera plus grand. C'est dire que des cuvettes rectangulaires seront préférables à des vases circulaires de môme surface. 180 CHAPITRE IX Enfin, on comprend qu'il faut aussi que le liquide nutritif soit mis en couche mince. En profondeur, il y a trop peu de surface pour le développement de la mucédinée, eu égard à la quantité de masse alimentaire. En couche très mince, il y a au contraire trop de surface végétante pour trop peu d'aliments. Le rapport de la surface à la profondeur doit donc avoir une valeur moyenne, dépendant de la composition du liquide nutritif. Avec celle qui est indiquée plus haut, on est dans les meilleures conditions possibles, quand on répartit les 1.500 centimètres cubes de li- quide dans une cuvette de porcelaine rectangulaire, abords ver- ticaux, et de dimension telle que le liquide y ait une hauteur de 30 à 35 millimètres. Si, lorsque toutes ces conditions sont réunies, on sème sur le liquide les spores du végétal, elles ne tardent pas à se dévelop- per, et, au bout de 24 heures, ou même de 18 heures, si elles n^étaient pas trop sèches, leurs filaments mycéliens enchevêtrés forment à la surface une membrane continue, d'aspect blanchâ- tre, recouvrant tout le liquide. Au bout de 48 heures, cette mem- brane est déjà très épaisse ; elle devient d'abord jaunâtre, puis brun foncé. Enfin, après trois jours de végétation, elle est deve- nue tout à fait noire. Son poids augmenterait encore pendant le quatrième jour et les suivants, mais beaucoup plus lentement que pendant les trois premiers. Comme on doit viser à obte- nir, toutes choses égales d'ailleurs, le poids de récolte le plus grand possible dans le môme temps, il y a utilité à enlever tout ce qui s'est formé de mucédinée, et à faire servir ce qui reste d'aliments nutritifs à la production d'une nouvelle récolte. On enlève avec les doigts la membrane très consistante du troisième jour, on la presse fortement dans la main, pour exprimer la majeure partie du liquide qui l'imprègne, on l'étend sur une soucoupe, on la sèche à 100'^ et on la pèse. Le liquide sous-ja- cent se trouve d'ordinaire être suffisamment ensemencé par les spores résultant de l'égouttage de la membrane : on remet le tout à l'étuve, et, au bout de trois jours, on obtient une nouvelle ré- colte plus faible que la première. Le liquide restant est alors â peu près épuisé, et incapable de donner une troisième récolte de poids appréciable. L'ensemble des deux premières forme un total d'environ 25 grammes, à un vingtième près, comme nous l'avons dit plus haut. xNUTRITlON MINERALE DES MICROBES 181 Nous avons donc réuni pour notre expérience les deux condi- tions que nous avons vu plus haut être nécessaires au succès. Notre récolte est d'abord très grande, ensuite aussi constante que possible. Pourrions-nous l'augmenter encore ? En d'autres termes, ne pourrions-nous pas, en ajoutant à notre milieu minéral des élé- ments nouveaux, élever le chiffre du poids de végétal qu'il peut produire avec un poids donné de matériaux nutritifs ? Nous avons le droit de nous poser cette question, puisque nous savons déjà que la suppression de l'un des éléments, qui entrent dans la constitution de ce milieu, diminue la récolte. Il est donc possible d'espérer qu'en ajoutant quelque chose à notre milieu, nous aug- menterons le rendement. Pour le savoir, ajoutons à notre milieu minéral, et de compo- sition connue, des substances minérales ou organiques complexes^ de composition inconnue, mais choisies parmi celles qui se re- couvrent le plus facilement à'aspergillus au contact de l'air. Il est probable que ces substances doivent renfermer tous les élé- ments utiles, et s'il y en a qui ne soient pas déjà contenus dans notre milieu minéral, nous en serons avertis par une augmenta- tion du poids de la récolte. L'expérience montre que l'on ne gagne rien par ce procédé, même en variant les essais le plus possible, et même on trouve, en comparant le milieu artificiel ci-dessus à des milieux organi- ques renfermant la môme proportion d'éléments solides que lui, que le liquide Raulin donne des récoltes beaucoup plus abon- dantes que les autres. Nous avons donc le droit de croire que ce milieu est à la fois nécessaire et suffisant. Nous rencontrerons du reste bientôt un autre fait conduisant à la même conclusion. 99. Influence des éléments minéraux, — Nous pouvons, dès lors, rechercher avec sécurité quel est le degré d'influence, sur le développement de Yaspergiiius, des divers éléments qui y concourent. Voulons-nous savoir, par exemple, par quel chiffre se mesure l'utilité de la potasse dans le liquide nourricier ? Fai- sons vivre pour cela la plante dans deux cuvettes jumelles, renfermant lune le liquide complet, l'autre le liquide sans potasse. Dans le premier cas, il se produira comme à l'ordi- naire, à 1 gramme environ près, 25 grammes de plante. Dans 182 CHAPITUE IX l'autre, il s'en produira 1 gramme seulement. La suppression de la potasse fait donc tomber la récolte au vingt-cinquième de ce qu'elle était ; nous dirons que son utilité se mesure par le nom- bre 25, et, en faisant le même essai pour les divers éléments mi- néraux, nous trouverons, en adoptant le môme mode d'évalua- tion que pour la potasse, les nombres suivants pour mesure de l'utilité des divers éléments minéraux : Ammoniaque 153 Acide pliospliorique 182 Magnésie 01 Potasse 25 Acide siilfuriquc 25 Oxyde de zinc 10 Oxyde de fer. 2,7 Silice 1,4 Les nombres de ce tableau, relatifs à l'ammoniaque, à l'acide phosphorique, à tapotasse, à la magnésie, si grands qu'ils soient, n'ont pas le droit de nous étonner. Il y a longtemps qu'on sait que tous ces corps sont d'excellents engrais, et si leur suppres- sion dans une culture n'a jamais amené des abaissements de récolte comparables à ceux que nous venons de constater, c'est que jamais on n'a été maître de la composition du milieu comme on l'est dans les expériences de M. Raulin. Mais le même tableau nous fournit des faits tout à fait imprévus. Nous y voyons, en effet; que la suppression du zinc ramène la récolte au dixième de ce qu'elle était, en d'autres termes la fait tomber de 25 gram- mes à 2-'", 5. L'intervention aussi active de cet élément dans un phénomène de végétation est un des résultats les plus curieux du travail que nous analysons. On peut en augmenter l'intérêt par une remarque toute natu- relle. Les chiffres ci-dessus mesurent en bloc l'utilité de cha- cun des éléments minéraux, mais ne tiennent pas compte des proportions variables de ces divers éléments. Par exemple, la quantité d'oxyde de zinc, qui fait baisser la récolte de 25 gram- mes à 2"'", 5, n'est que de 4 centigrammes, renfermant seulement 32 milligrammes de zinc. L'action de cette faible quantité de métal suffit donc à produire une plus-value de 22''', 5 dans la récolte, c'est-à-dire d'un poids de plante 700 fois supérieur au sien. Ce chiftre a même pu, dans quelques expériences, s'élever jusqu'à NUTHITION MINÉRALE DES MICROBES 483 953, et ce nombre peut à son tour être considéré comme mesu- rant ce qu'on peut appeler Ytitilitr spécifique du zinc pour la ré- colte. En étudiant de la même manière les autres substances, M. Raulina trouvé les nombres maxima suivants pour la quan- tité de mucédinée que peut servir à former un gramme des di- vers éléments du milieu type. Azote (de l'ammoniaque) M Potassium (de la potasse) 64 Phosphore (de l'acide phosphorique) ... 157 Magnésium (de la magnésie) 200 Soufre (de l'acide sulfurique) 346 Zinc (de l'oxyde de zinc) 933 Fer (de l'oxyde de fer) 857 Silicium (de la silice) 320 Tous ces nombres sont notablement différents de ceux du tableau qui précède, et pour le zinc en particulier, le caractère étrange de son intervention s'accentue encore plus ici. Nous au- rons bientôt à nous demander en quoi consiste cette influence singulière. Contentons-nous pour le moment de l'enregistrer, et de remarquer que la plante, pour se donner ce zinc qui semble lui être si utile, est obligée de le puiser dans un liquide où il est dilué au 1/50.000. De quelles proportions infinitésimales d'un élément utile peut dépendre la santé d'un être vivant, la pros- périté d'une culture ! Enfin, si l'on songe que sur un liquide qui contient seulement 1/50.000 de zinc, une ou deux générations d'aspergillus peuvent, en absorbant complètement ce métal, rendre l'existence d'une nouvelle génération cbétive ou impossible, que sur un tel liquide un nouvel ensemencement, j'allais dire une nouvelle inocula- tion, resterait sans effet, qui pourrait ne pas être surpris de la perspective qui s'ouvre sur les propriétés si merveilleuses et si étranges du vaccin, qui ne s'implante pas deux fois de suite sur le même organisme ? Mais notre végétal est encore plus sensible, s'il est possible, à l'action des éléments qui lui sont nuisibles, i^joute-t-on au liquide nourricier 1/1.(300.000, un ^eize cent millième de nitrate d'ar- gent, la germination des spores devient impossible. Elle ne peut même pas commencer dans un vase d'argent, bien que la cbimie soit presque impuissante à montrer qu'une portion de la matière 184 CHAPITRE IX du va«e se dissout dans le liquide. Mais la plante l'accuse en ne germant pas. Elle accuse de même l/oOO.OOO de sublimé corro- sif, 1/8.000 de bichlorure de platine, 1/240 de sulfate de cuivre. Notons pourtant que ces doses, suffisantes pour empocher la germination des spores, sont insuffisantes pour arrêter la crois- sance de la plante quand elle est en pleine évolution. C'est là une notion que nous retrouverons plus tard à propos des anti septiques. lOO. Rôle physiologique des éléments minéraux. — L'é- tude physiologique du milieu artificiel propre au développement de Yaspergillus, telle que nous la comprenons, exige la solution de deux ordres de questions. Il faut démontrer l'influence de cha- cun des éléments de ce milieu, puis déterminer le rôle physio logique de chacun d'eux. Nous venons de lésoudre à peu près complètement la première question pour les éléments minéraux, mais nous n'avons pas abordé la seconde. Les seuls faits précis que Ton ait sur ce sujet important ont été trouvés par M. Raulin, et il les a rencontrés en mettant en œuvre une méthode de vérifi- cation des résultats précédents dont nous devons dire un mot. Mettons à l'étuve deux cuvettes identiques contenant chacune du liquide Raulin complet, moins un seul élément. Les récoltes que nous obtiendrons sur les deux seront tout d'abord à peu près égales, et faibles. Quand nous en aurons obtenu deux ou trois, ajoutons, dans l'un des essais seulement, l'élément qui manque. Là, les récoltes vont s'élever tout à coup et devenir très supé- rieures, à la fois aux récoltes précédentes de la même cuvette, et aux récoltes de même ordre du milieu resté incomplet. De cette doul)le comparaison, de ce changement subit dans la va- leur des nombres, résultera jusqu'à l'évidence l'efficacité de félément ajouté. L'expérience, faite dans les conditions que je viens d'indi- quer, sur le sulfate d'ammoniaque, ou le sulfate de zinc, par exemple, donne bien le résultat prévu à l'avance, et confirme ce que nous avons appris plus haut sur l'utilité de ces deux corps. Mais, avec le sulfate de fer, il n'en est plus de même. L'addition du fer dans un milieu qui a nourri plusieurs récoltes languis- santes ne rend pas la végétation plus prospère, et ne relève guère le poids de la récolte au-dessus de sa valeur primitive, ni au-des- NUTRITION MINERALE DES MICROBES 185 sus de la valeur qu'elle conserve dans le milieu qu'on a laissé privé de sel de fer. Si donc ce milieu, auquel on a ajouté le fer, est resté im- propre aune végétation vigoureuse, ce n'est pas qu'un élément essentiel y manque, c'est que, par le fait même du développe- ment de Yaspergilius en l'absence des sels de fer, il a dû se for- mer une substance vénéneuse pour la mucédinée, substance que les sels de fer empêchent de se produire, mais ne peuvent détruire. Cette interprétation des faits est d'accord avec une remarque qu'on peut faire sur le mode de fructification de Vaspcrgilliis en l'absence des sels de fer. L'évolution de la spore semble alors d'autant plus pénible que le milieu, où elle germe, a déjà nourri un plus grand nombre de récoltes. Or, on n'observe rien de pareil dans un milieu où manque un élément essentiel autre que le fer. D'ailleurs, voici qui semble démontrer la formation d'un com- posé spécial en l'absence des sels de fer. Le liquide privé de fer, qui a déjà fourni deux ou trois récoltes, donne une coloration rouge avec un sel quelconque de sesquioxyde de fer; la subs- tance qui donne cette coloration est destructible par le chlore, le permanganate de potasse. Toutes ces réactions appartiennent à l'acide sulfocyanhydrique, mais il n'y a encore rien de démon- tré au sujet de la présence réelle de ce corps. Quoi qu'il en soit, on voit que les sels de fer semblent jouer, dans la physiologie de Yaspergilius, un tout autre rôle que les sels de zinc. On aurait pu croire,, en se fondant sur certaines considérations d'ordre purement chimique, que ces deux corps, fer et zinc, pouvaient se substituer l'un à l'autre. M. Raulin avait déjà démontré, par la méthode que nous avons indiquée en premier lieu, que cette substitution était impossible. Les ex- périences que nous venons de relater nous donnent comme la raison physiologique de cette impossibilité. Elles nous permettent aussi de ne pas nous étonner de l'appa- rente singularité qu'il y avait à voir apparaître le fer comme élément utile dans la formation d'une plante qui ne contient pas de chlorophylle. Mais, en revanche, on peut en conclure aussi qu'il y a peut-être quelque chose de trop absolu à vouloir tou- jours rattacher la présence du fer à la création d'une matière colorante, comme on le fait quelquefois en physiologie végétale. 186 CHAPITRE IX Enfin, il y a une dernière remarque à faire à propos du cal- cium, dont la relation avec la formation des organes foliacés semble aussi assez généralement acceptée. Uaspergilhis niger semble ne pas avoir besoin de cet élément. Il est vrai qu'il ne possède pas de feuilles, mais les filaments qu'il dresse dans l'air sont d'actifs agents d'évaporation, comme les feuilles. Nous ver- rons d'un autre côté que des cellules vivant complètement plon- gées dans l'eau, comme celles de la levure, ont besoin d'un sel de chaux. Concluons-en que toutes nos connaissances sur ce sujet et toutes nos idées sont encore très imparfaites. C'est en ces quelques faits que se résume tout ce que nous sa- vons sur le rôle physiologique des éléments minéraux dont nous avons montré Futilité pratique. Il est clair qu'ils ne sont pas suffisants, et qu'il y a de ce côté une étude à faire. Le végétal assimile-t-il aveuglément, en bloc et sans ordre, les divers sels qu'on lui offre, ou fait-il entre eux un choix, suivant qu'il s'agit de former son mycélium ou ses organes de fructification? C'est le second cas qui est probable. Certains sels sont sans doute plus nécessaires pour la formation des spores, qui sont plus azotées que le reste de la plante, et comme il n'y a pas de ma- tière protéique sans phosphore, c'est peut-être à ce moment que les phosphates sont plus volontiers absorbés. Bien qu'on n'ait pas de connaissances précises sur ces ques- tions délicates, on peut néanmoins tirer quelques conclusions des faits que nous connaissons déjà. L'expérience montre d'abord que, si imparfait, si incomplet que soit le milieu où on fait vivre VaspergiUus^ la plante ne s'ar- rête jamais à moitié chemin dans son évolution, et aboutit tou- jours à la formation de la spore. Son mycélium est plus ou moins grêle, plus ou moins rameux, les spores sont plus ou moins nombreuses, mais le végétal en produit toujours. Ceci n'est pas, en apparence;, favorable à l'idée qu'il y a, dans le mi- lieu minéral, des éléments plus utiles au système nutritif, d'autres, plus utiles au système reproducteur. Il semble qu'ils aient tous le môme rôle, et qu'aucun d'eux ne soit, à proprement parler, indispensable au végétal, puisque le cycle de végétation peut se fermer sans lui. Prise dans un sens absolu, cette conclusion serait inexacte, parce qu'il est impossible de constituer un milieu absolument NUTRITION MINÉRALE DES MICROBES 187 pur de tel ou tel élément. On a beau prendre, pour cultiver Yaspergillus, du sucre candi parfaitement blanc et cristallisé, des sels minéraux dans le plus grand état de pureté, on ne peut jamais affirmer que la plante ne rencontrera pas, dans le mélange cpi'on lui ofl'rc, le corps cfonton a voulu la priver. Son organisme est un réactif autrement sensible que la plupart de nos procédés chimiques, et nous avons vu qu'elle manifestait, en refusant de vivre dans une capsule d'argent, l'existence d'une quantité de sel d'argent que n'atteignaient pas les réactifs pourtant si sen- sibles de ce corps. D'ailleurs, nous verrons, à propos de la fer- mentation alcoolique, que le sucre candi le plus pur contient d'assez notables quantités d'azote et de soufre. D'un autre côté, en admettant la pureté exemplaire des sels employés, les parois de la capsule de porcelaine ne sont pas absolument insolubles, et peuvent laisser passer en solution dans le liquide une partie de leurs éléments constituants. Enfin, quand même on aurait tout à fait réussi à éliminer du liquide un corps déterminé, il faut bien y ajouter de la semence, des spores, qui apporteront avec elles un peu de sels minéraux, qu'une loi naturelle accu- mule en effet dans les graines, et les abandonneront peu à peu, au fur et à mesure de la germination, aux organes nouvel- lement formés. Si donc, en supprimant à la plante successivement chacun des éléments de son milieu nutritif, on n'arrive pas à l'arrêter dans son évolution, il faut en conclure, non pas qu'aucun de ces élé- ments n'est absolument indispensable à Yaspcrgillus, mais seu- lement que ce végétal a la faculté de se contenter quelquefois de très peu sous ce rapport. Quand il rencontre autour de lui l'élé- ment utile, il l'absorbe, et traduit ces conditions de vie facile par une grande exubérance de développement. Quand il n'en a que très peu, quand il est olîligé, par exemple, de se contenter de celui qu'il trouve dans la graine, il réduit ses organes et leurs besoins, il leur distribue parcimonieusement tout ce dont il peut disposer, et arrive en s'épuisant, et en épuisant peu à peu tous ses tissus, à fournir des spores, douées, il est vrai, de peu de vita- lité, incapables de recommencer une vie aussi pénible que celle qui leur a donné naissance, mais n'ayant besoin que de rencon- trer un milieu favorable pour revenir à la santé, et assurer la perpétuité de l'espèce. 188 CHAPITRE IX Aussi, si grands que soient les chiffres par lesquels nous avons représenté Futilité spécifique des éléments minéraux du liquide Raulin, sont-ils encore de beaucoup au-dessous de la réalité. Si 1 gramme de zinc, par exemple, peut amener la formation de 9o3 grammes de plante, ce chiffre ne représente que la diffé- rence entre la production du milieu complet et celle du milieu qu'on suppose avoir été privé de zinc, parce qu'on n'en a pas mis sous forme minérale. Si l'on pouvait obtenir un liquide Raulin absolument pur de cet élément, on verrait l'adjonction d'un peu de zinc élever bien plus le niveau de la récolte. Nous verrons, à propos de la levure, que ce végétal est ca- pable de déployer, vis-à-vis de l'oxygène, cette même parcimo- nie dans l'emploi que Yaspergillus nous montre à propos du zinc, et que, sous ce point de vue, l'oxygène ressemble aux autres éléments minéraux. lOl. Conclusions générales. — Toutefois, ces réserves faites, il n'en est pas moins très curieux, au point de vue de l'étude des végétaux supérieurs, de voir la prospérité d'une récolte dépendre, dans une aussi large mesure, de l'existence de cer- tains éléments en quantités extrêmement petites. Combien il est peu probable, si les phénomènes de végétation sont aussi com- pliqués chez ces plantes microscopiques, qu'ils soient, chez les végétaux supérieurs, aussi simples qu'on le professe quelque- fois. Lorsque, pour assurer la bonne tenue d'une culture, on se contente de rendre au sol du phosphore, de la potasse, de la magnésie et des composés azotés, n'est-il pas évident qu'on compte sur le sol pour fournir les autres éléments utiles, sans savoir quels ils sont. Si le sol peut faire ce qu'on lui demande, tout va bien; s'il ne le peut pas, ou si à un moment donné il ne le peut plus, et si l'élément disparu de la sole est du même ordre que le zinc pour ïaspergiliiis, par exemple, on voit la récolte baisser, et on pourra dès lors augmenter la dose d'en- grais potassique ou azoté au delà de toute mesure, on verra cette fumure intensive échouer là même où elle réussissait na- guère. C'est que le problème de l'alimentation minérale n'est pas résolu pour les plantes, tandis qu'il l'est pour Vaspergillus. Un jour viendra peut-être où on renoncera aux fumiers encombrants NUTRITION MINERALE DES MICROBES 189 et coûteux, où ragriculteur aura dans son grenier, dans des sacs étiquetés, la quantité d'engrais à répandre sur un hectare de ses divers terrains pour en tirer telle ou telle récolte. L'expérience de Vaspergillus prouve que cela est possible, mais l'exporiencc •agricole prouve que ce moment n'est pas encore venu. Il peut sembler surprenant de voir étendre de piano, aux grands végétaux, les conclusions auxquelles nous sommes arrivés pour notre aspergilhis. Mais il faut remarquer que si la plante est microscopique, la récolte ne l'est pas. 25 grammes de plante à l'état sec, récoltés en six jours sur une cuve de porcelaine comme celles que nous avons employés, représentent de 500 à 600 k. de récolte à l'état sec par hectare, ou 3.500 à 4.000 k. à l'état hu- mide. La comparaison n'est pas parfaite, caria plante de grande culture crée elle-même sa matière organique aux dépens de l'acide carbonique de l'air, tandis qu'il faut fournir à Vaspergil- lus un aliment tout préparé. Mais, au fond, c'est, dans les deux cas, un phénomène d'alimentation qui est en jeu, phénomène dont nous connaissons les conditions pour la plante microsco- pique, tandis que nous en ignorons le détail intime pour les plantes agricoles. Or nous voyons que ce détail ignoré peut avoir une grande importance sur le résultat. Ce n'est pas tout. Nous n'avons jusqu'ici étudié que la sensi- bilité de V aspergilius au sujet de sa nutrition minérale. Il nous reste à mettre en regard de cette sensibilité son insensibilité ap- parente au sujet de l'absence de quelques-uns de ses éléments utiles. Nous avons vu que le liquide Raulin donne des cultures plus prospères et plus abondantes que le milieu organique le mieux approprié. Que veut dire cela, sinon que dans ses milieux organiques habituels, Y aspergilius n'a pas tout ce qu'il lui faut et vit plus ou moins de privations? Cela ne l'empêche pas de vivre, de se multiplier, de donner une série indéfinie de générations fé- condes. Depuis l'apparition de la vie à la surface du globe, il se perpétue ainsi, dans des conditions qui rappellent celle de la cul- turc dans la cuvette sans zinc, ou sans fer, ou sans soufre. La plante peut donc se passer d'un ou plusieurs des éléments qu'elle aime, non pas indéfiniment, caries hasards de l'ensemencement et de la culture font varier, dune culture à l'autre, l'élément mi- néral qui fait défaut. Nous verrons bientôt que, privée pendant plusieurs générations d'un de ses principes essentiels, la plante 190 CHAPITRE IX s'étiole. Elle ne supporte la disette que parce que c'est tantôt de l'un, tantôt de l'autre qu'elle est privée. 11 n'en résulte pas moins de cette observation qu'une plante peut vivre sans avoir tout ce quil lui faut, et qu'elle sait se plier aux privations. Son proto- plasma n'a donc pas toujours, même au point de vue de sa ma- tière minérale, la même constitution, et ainsi, à côté delà sensibi- lité merveilleuse que nous avons reconnue à Yaspergillus, il faut, pour être complet, parler de son indifférence. Seulement, à cette indifférence il y a un correctif. La plante qui a poussé sur du liquide Kaulin privé d'un de ses éléments, ou, ce qui revient à peu près au même, sur les liquides organi- ques qui la nourrissent le plus facilement, est loin, nous l'avons vu, de prendre le développement qu'elle prend sur le liquide Raulia complet. Sa croissance est incertaine, soumise à une foule de hasards ou de caprices apparents. Elle rencontre autour d'elle des parasites qui la gênent et quelquefois l'étoufïent. Ce sont là exactement les conditions des plantes de nos champs et de nos jardins. Mauvaises herbes, maladies parasitaires, tout cela se rencontre dans les cultures les mieux soignées. Sur un liquide convenable, au contraire, Yaspergitlus donne une couche serrée, homogène, d'aspect vigoureux, et au lieu d'être entravé par les espèces parasites, c'est lui qui étouffe toutes les végétations qui pourraient tenter de lui disputer la place. Ne nous bornons pas au règne végétal, transportons cette notion sur un plus grand théâtre. Nous verrons qu'elle n'est pas autre chose que le combat pour l'existence entre les êtres de la création. Ils ont tous leurs ennemis ou leurs parasites ; leur loi commune est de manger ou d'être mangés, et il ne manque pas de prétendues lois naturelles permettant de s'ex^îli- quer comment ils arrivent à résoudre ce dilemme dans le sens le plus favorable. Avec notre aspergillus, la solution est plus sim- ple. Nous connaissons avec lui les conditions de la lutte. Elles sont d'ordre purement chimique. On peut bien dire que Vas- perg'dhis n'écrase ses ennemis que parce qu'il est vigoureux, mais il n'est vigoureux que parce qu'il trouve dans son milieu nutritif tous les éléments dont il a besoin. Si l'un d'eux lui man- que, il vit encore, mais plus péniblement, et sa force de résis- tance diminue. Si plusieurs lui font défaut, il s'étiole et cède la NUTRITION MINÉRALE DES MICROBES 191 place à une espèce voisine, moins exigeante que lui, ou ayant des besoins différents qui sont mieux satisfaits. On sent, sans qu'il soit besoin d'insister, qu'il doit y avoir des phénomènes analogues dans la vie des animaux et des végétaux supérieurs. Mais, en les étudiant, nous nous écarterions de notre domaine. 11 vaut mieux y rester confîués.INous y rencontre- rons souvent cette notion de la lutte entre deux microbes se dis- putant un terrain commun, et nous aurons souvent à faire appel à la notion claire que nous venons d'en prendre, et qui ne se présentera que rarement à nous avec la même précision. BIBLIOGRAPHIE J. Raulin. — Eludes chimiques sur la végétation. — Reclierches sur le dé- veloppement d'une mueédinée dans un milieu artificiel. Ann. des sciences naturelles, 1870. CHAPITRE X ALIMENTATION IIYDROCARBONÉE Les connaissances que nous venons d'acquérir au sujet deTa- limentation minérale de Yaspergilhis font de ce petit végétal un admirable outil d'expérience, dont la science n'a pas encore tiré tout le parti possible. Dans le liquide Raulin, l'azote n'est fourni à la plante qu'à l'état de sel ammoniacal. Les seuls aliments or- ganiques sont des aliments ternaires, le sucre et l'acide tartri<|uc. Supposons que nous voulions comparer à l'ammoniaque d'autres aliments azotés, au sucre d'autres aliments hydrocarbonés : il suffira de faire la substitution dans le liquide nutritif, et de voir comment se comporte la plante dans le liquide modifié et dans liquide type. Toutes les différences observées seront imputables au changement d'aliments, car on est sûr que, par ailleurs, la plante trouve tout ce qu'il lui faut dans le liquide. Ces études sur l'alimentation, d'ordinaire si difficiles et si contin- gentes, prendront ici leur maximum de netteté. Il y a pourtant place pour une petite ambiguïté que nous allons d'abord faire disparaître. Elle est relative à l'existence simulta- née, dans le liquide Raulin, de l'acide tartriqne et d'un autre aliment bydrocarboné. Il faudrait, pour assurer l'expérience, que ce dernier soit seul. On arrive à ce résultat en remplaçant l'acide tartrique par l'acide sulfurique. 102. Rôle de l'acide tartrique. — L'acide tartrique joue, en effet, un double rôle dans le liquide nutritif. Il en maintient l'acidité d'abord, puis il subit Lii-même une combustion véri- table. Il est d'abord utile, pour queVaspergilhis se dévelop^DC bien, que le liquide Raulin soit un peu acide. Si l'on n'ajoutait pas d'acide tartrique, ce liquide, à raison du carbonate de magnésie qui entre dans sa constitution, serait un peu alcalin, et, comme ALIMENTATION IIYDIÎÔCAHBONEE 193 tel, risquerait d'être envahi, dans nos cuves ouvertes, par des l)actérics et autres productions, alors même qu'on y aurait ense- mencé largement des spores d\ispr?'f/i/Ins. On peut faire, à ce sujet, une expérience particulièrement intéressante et probante. Sur deux liquides nourriciers avec sucre et éléments minéraux, mais l'un avec et l'autre sans acide tartrique, on sème Yaspcrgil- lus. Le liquide complet donne une très lielle récolte au bout de trois jours. Sur l'autre, le développement est nul ou insignifiant. En revanche, le premier liquide reste limpide, le second se trou- ble et se peuple d'espèces vivantes et agiles, appartenant au monde des bactéries. Dans le second liquide on ajoute alors de l'acide tartrique. Presque aussitôt, la scène change. Les spores de lamucédinée, jusque-là inertes, ou n'ayant subi qu'un com- mencement de germination, reprennent le dessus, se développent activement et donnent une récolte aussi belle que dans Fautre liquide. On ne leur a pourtant fourni aucun aliment nouveau, car nous verrons bientôt que si l'acide tartrique est définitivement brûlé, il est à peu près respecté tant qu'il est en présence du sucre. En d'autres termes, les spores ont eu dès l'origine tout ce qu'il leur fallait pour se développer, mais les conditions de milieu n'étaient pas favorables, et leur vie est restée latente jusqu'au moment où ces conditions ont changé. Il peut même arriver, et ilarrive souvent que cette substitution de Yaspergillus aux bactéries se fait sans qu'on ait besoin d'in- tervenir, par un mécanisme vital dont il est bon de dire un mot. Le sucre, sous l'influence des ferments qui pullulent dès l'origine dans le liquide neutre, se transfoi-me fréquemment en produits acides. La vie des ferments leur crée, dans ce cas, un milieu qui leur est défavorable, et qui devient, au contraire, de plus en plus favorable à la mucédinée. Les spores, à un certain moment, de- viennent donc tout naturellement capables d'étoulier les espè- ces qui avaient, tout d'abord, envahi victorieusement le terrain. Ce qui prouve d'ailleurs que l'acide tartrique agit alors en tant qu'acide, et non pas comme composé hydrocarboné, c'est qu'il peut être remplacé dans ce rôle par un autre acide, tel par exemple (pic l'acide sulfurique. Seulement, avec ce dernier, il faut diminuer un peu les doses, parce que l'acide sulfurique est mortel pour la mucédinée à la dose de 1/500 dans le liquide Uaulin, peut-être parce <|u'il y met en liberté de l'acide nitrique. 13 194 CHAPITllE X Mais à la dose de 1/1000, il est inoffensif, et remplace alors très bien l'acide tartrique. L'acide tartrique n'agit pas seulement comme acide, il agit aussi comme aliment hydrocarboné. En semant des spores d'ay- pergillus sur un liquide Raulin sans sucre, on les voit germer, former leur mycélium et leurs spores, subir enfin leur évolution complète. Le mycélium se dévelopj)e peu, beaucoup moins qu'a- vec le sucre ; il est même quelquefois si réduit, que les filaments sporifères semblent implantés directement sur le liquide. Dans ces conditions, l'acide tartrique est peu à peu brûlé, et disparait en entier. On peutdoncprévoir que lorsque la mucédinée pousse sur du liquide Raulin complet, contenant du sucre et de l'acide tartri- que, elle va peu à peu brûler aussi cet acide. Je me suis assuré qu'il en est, en effet, ainsi ; mais la destruction de l'acide tartri- que ne commence qu'à la fm de l'expérience, lorsque la plante a poussé, a consommé presque tout le sucre, et lorsque ce sucre devient rare. La plante brûle alors l'acide tartrique, et le mi- lieu où elle a vécu devient tout à fait neutre, quand on laisse à l'action le temps de s'épuiser. Les résultats que M. Raulin a trouvés, en étudiant les effets physiologiques de diverses quantités d'acide tartrique, sont tout à fait d'accoi'a avec ce qui précède. Avec 1/1000 d'acide tartrique, le milieu a été envahi par des infusoires, et les spores de la mu- cédinée ne se sont pas développées. A partir de cette quantité mi- nima jusqu'à la proportion de 63 grammes par litre, le poids de la récolte a été à peu près constant, ce qui ne s'expliquerait guère si lacide tarti-ique était un aliment comparable au sucre. Au delà de cette limite de 6,3 p. 100 d'acide tartrique, le poids des récol- tes diminue et devient à peu près nul pour une proportion d'a- cide de 25 p. 100, ce qu'il faut attribuer à l'acidité excessive du milieu. 103. Rôle du sucre. — Le sucre est l'aliment de prédilection de V(ispergi////\, et voici ce qui lui mérite ce titre, c'est qu'avec lui, le cycle évolutif du champignon, de la spore à la spore, est plus rapide et plus complet qu'avec tout autre aliment hydro- carboné. Suivons-en les diverses phases. Le premier point à noter est ALIMENTATION HYDROCARBONÉE 195 que ce sucre, tel qu'il est olï'ert k la plante, c'est-à-dire sous forme de saccharose, est iuassimilablc. Pour pouvoir l'utiliser, Yaspei-ylllus doit l'intervertir, à l'aide d'une diastase qu'il sécrète pour cela. Par là s'ouvre ce chapitre des diastases, trop impor- tant pour que nous puissions faire autre chose que de le signa- ler ici. Si facile que soit cette transformation, elle n'est pas instan- tanée. Même dans du liquide Rauliu, où VasperglUu.s pousse si vite, il y a encore du sucre cristaliisable plus de 48 heures après l'ensemencement, et, par suite, la plante n'est pas mise dès l'abord en présence de toute sa matière alimentaire. Que l'action de la diastase représente une difficulté vaincue, et par suite une perte de temps et de force, ou que la plante ait avantage à trou- ver de suite tout son aliment préparé, toujours est-il qu'il y a bénéfice à intervertir le sucre avant de l'introduire dans le liquide Raulin. Si on met, en effet, en train, au même moment, deux essais identiques, mais l'un avec du sucre candi, l'autre avec du glucose ; on voit que ce dernier prend dès les premiers moments une avance sur l'autre. Et voilà une notion qui a été utilisée de- puis, par exemple pour activer la fermentation alcoolique du sucre. La levure, comme Yaspergillus, préfère, en effet, le glucose au sucre candi. Une fois transformé, le sucre est immédiatement mis en œuvre par la plante, et semble entrer à l'état de matière première dans une usine bien tenue, où tout marche avec régularité. Poumons faire une idée de ce qui se passe, mettons simultanément en expé- rience plusieurs cuvettes identiques, et, à diverses intervalles, comparons dans l'une d'elles le poids de plante produite au poids du sucre disparu. Nous trouverons que, tout à fait au début de la germination, le poids de plante, qui représente pour nous le produit de l'usine, est une fraction notable du poids du sucre consommé, la moitié, ou même davantage. Il faudrait, pour pou- voir donner des chiffres plus précis, tenir compte du poids des spores ensemencées, qui apportent évidemment leur part de matière organique et fournissent une partie du tout jeune mycé- lium. Mais bientôt tout se régularise. Le rapport enti-e le poids de plante obtenu et le poids du sucre consommé se fixe au voisi- nage de 1/3, et ne varie plus jusqu'au moment de la fructifica- tion. A ce moment la plante a cessé de pousser, du moins de 196 CHAPITRE X pousser aussi activement. Elle a passé à l'état de plante adulte, et il est clair qu'on peut maintenant, poui* entretenir sa vie, lui faire consommer beaucoup de sucre sans qu'elle augmente beau- coup de poids. Mais tant qu elle est jeune et (ju'elle prolifère, elle donne couramment environ 1 de plante pour 3 de sucre, ce qui revient à dire que la fabrique donne en cellules vivantes un rendement de 33 0/0 environ du poids de sa matière première. On arrive à la môme conclusion en changeant les conditions de l'expérience. On peut, comme l'a fait Raulin, mettre simulta- nément en observation des cuvettes en tout identiques, sauf qu'elles renferment des quantités de sucre croissantes depuis zéro jusqu'à 1 5 grammes par litre. On trouve, en enlevant la récolte au moment de la fructification, c'est-à-dire en l'arrêtant partout au même point, que son poids est à peu près proportionnel au poids du sucre employé. 11 augmente pourtant un peu plus len- tement jusqu'à 12 0/0 de sucre, et, au-delà de 15 0/0, il diminue indéfiniment, sans doute par suite de la difficulté que les cellules ont à vivre dans un milieu à si fort pouvoir osmotique. L'important est qu'à l'origine, et jusqu'à 12 0/0 de sucre, le poids de plante soit encore environ de 33, pour 100 de sucre consommé. C'est à peu près celui que nous avons signalé dans le chapitre précédent, 25 gr. de plante pour 70 gr. de sucre dis- paru. Donc encore ici. avec 3 de sucre, nous obtenons 1 de plante Avant de pousser plus loin l'étude physiologique de ce procès d'alimentation, demandons-nous si nous ne pourrions pas amé- liorer ce rendement. Pourrions-nous encore réduire ce rapport déjà très faible, le rapprocher, par exemple, du rapport 2/1, réalisé dans les premières phases de la germination. Cela est probable, bien que, pratiquement, Raulin n'ait pu y réussir. 11 est probable qu'en facilitant mieux le jeu de l'absorption et de la sécrétion, en assurant encore mieux la présence de l'oxygène, en ajoutant au liquide telle substance activant sa fonction cellu- laire, on changerait le jeu des assimilations et des combustions, de façon à diminuer les dernières au profit des autres. Mais on ne pourra aller très loin dans cette voie, et il y a une limite impossible à dépasser. Il est facile de voir que le poids du sucie détruit dépasse toujours celui du végétal produit. ALIMENTATION lîYDROCAUBONÉFJ 1!)7 104. Dépense de construction et dépense d'entretien. — l*ni"tons. en effet, de ce fait (jue le poids de la plante atteint tout au plus le tiers du poids du sucre. La composition du végétal est évidemment très différente de son aliment. Il y a de la ma- tière grasse et de la cellulose provenant du sucre, des matières azotées complexes formées de toutes pièces, par la combinaison de l'azote de l'ammoniaque avec des matières hydrocarbonées provenant du sucre. Les éléments de celui-ci ont donc subi des groupements nouveaux, dont le détail est malheureusement in- connu, mais dont nous pouvons apprécier Tensemble. Or, l'expé- rience apprend que, quand la plante est faite, elle renferme pro- portionnellement plus de carbone et moins d'oxygène que le sucre dont elle provient ; qu'elle dégagerait en brûlant plus de chaleur qu'un poids égal de sucre, et que, par suite, ses tissus n'ont pu se produire que moyennant la dépense d'une certaine quantité de chaleur. C'est pour se la procurer que la plante a brûlé, aux dépens de l'oxygène de l'air, qu'elle consomme pendant tout son procès de végétation, une partie du sucre qu'elle trouvait dans son liquide nutritif. De ce sucre, une portion a disparu, transfor- mée complètement en eau et en acide carbonique, pour qu'une autre portion pût s'élever à un niveau d'organisation supérieur. Pendant que l'une redescendait la pente, l'autre, plus petite, la remontait, et la création du végétal exigera toujours, par suite, la destruction plus ou moins complète d'une certaine quantité de matière organique combustible. De plus, il ne s'agit pas seulement de créer le végétal, il faut aussi faire vivre les parties déjà formées. Ce végétal n'est pas de ceux qui peuvent faire de la matière organique aux dépens de la lumière solaire. De la double fonction des cellules végétales, création et destruction, il no possède que la seconde ; il a besoin d'aliments tout faits, qu'il décompose d'un bout à l'autre de son existence. De là l'utilité d'une nouvelle dépense, que nous pou- vons appeler dépense d'entretien, pour la distinguer de l'autre que nous appellerons drpensc de construction. C'est à fournir à cette double dépense cjue sert le sucre qu'on ne retrouve plus ni sous forme de sucre, ni sous forme de carbone, d'hydrogène et d'oxygène agrégés aux tissus vivants de la mucédinée. Avec cette idée de corrélation entre la dépense de construc- tion et la dépense d'entretien de certaines cellules, d'un côté, de 498 CHAPITRE X l'autre avec la quantité de matière alimentaire transformée ou disparue, nous revenons à la définition du mot ferment telle que nous l'avons donnée dans le premier chapitre. Nous creuse- rons de plus en plus cette définition dans la suite de cet ouvrage ; mais déjà nous pouvons la regarder comme résidant surtout dans le rapport entre le poids de matière alimentaire détruite, et le poids de matière vivante entrée en action pendant le phé- nomène. 11 est difficile de dire pour notre aspergilliis, comme pour un ferment quelconque, quelle est la valeur exacte de ce rapport. Il faudrait savoir le poids de sucre mis en œuvre physiologique- ment par la plante, et entré dans ses tissus, dans sa constitution. Dans l'ignorance où l'on est de ce point, on ne peut raisonner que par à peu près, mais ce n'est pas faire une hypothèse trop éloignée de la réalité que d'admettre que le poids du sucre est très voisin du poids de la plante. Dans tous les cas, tant que nous parlerons d'une même substance, le sucre, comme ses di- vers ferments ont des compositions élémentaires très voisines, tous les nombres que nous fournira l'hypothèse que nous venons de faire seront à peu près proportionnels. Nous dirons donc que pour Vaspergillus il faut dépenser trois parties de sucre pour avoir une partie de plante, et que sur ces trois parties deux seront employées à l'organisation de la troisième. La puissance comme ferment de YaspergiUus nigcr peut donc se mesurer par le nombre deux. On voit qu'il n'est pas bien considérable, et, sous ce rapport, on a le droit de comparer les phénomènes produits par ce vé- gétal microscopique à ceux qui se produisent pendant une cer- taine période de la vie des plantes supérieures, le moment de leur germination. Là, aussi, nous voyons une plante jeune vivre aux dépens des matériaux nutritifs accumulés dans la graine, consommer aussi l'oxygène de l'air, et si l'on arrête la germina- tion au moment où commence à apparaître le chlorophylle, au moment où la plante va pouvoir utiliser à son aise la chaleur du soleil, on trouve que le poids de la jeune plante est inférieur au poids de l'amidon qu'elle a consommé, qu'elle a dû en brûler une partie pour pouvoir édifier ses tissus au moyen de l'autre, qu'elle a, par conséquent, agi comme un ferment, et que sa puissance, sous ce rapport, est du môme ordre que celle de YaspergiUus. iXous ALIMENTATION HYDROCARBONEE 199 avions déjà rencontré cette notion (44). Mais elle est devenue ici beaucoup plus précise. Nous n'en avons pas d'ailleurs fini avec elle et nous la retrouverons au chapitre suivant. 105. Autres matières hydrocarbonées. Sucres. — Com- parons maintenant au saccharose les autres aliments hydrocar- honés de Vaapergillus, et pour cela commençons par les sucres. Nous savons déjà que le sucre interverti est un aliment un peu meilleur que le saccharose. Le lactose se tient, en revan- che, à un niveau tout à fait inférieur. Ensemencées dans un li- quide Raulin, où le lactose remplace le sucre candi, les spores ne germent que péniblement, et le mycélium s'arrête après un court développement, comme s'il avait seulement utilisé les matériaux de la spore. Le lactose n'est donc pas l'équivalent du sucre au point de vue de la sporulation ou de la nutrition des jeunes tissus. Il peut pourtant servir à entretenir la vie de la plante adulte. Produisons, en effet, à l'aide de liquide Raulin, un mycélium abondant et feutré, puis, après l'avoir fait séjour- ner une ou deux heures, pour le bien laver, sur un bain d'eau ordinaire, transportons le, fout d'une pièce, sur un liquide Raulin à lactose au lieu de sucre : nous verrons que la plante y vivra, y terminera sa fructification si elle l'avait commencée, et même augmentera de poids. Cette augmentation du poids sec témoi- gne que le lactose peut servir d'aliment de construction, mais sous ce point de vue il est très inférieur au sucre, et en forçant un peu la note, nous pourrons dire que le lactose ne fournit pas de matériaux de construction. Il ne fournit guère que des ali- ments d'entretien. La mannite se comporte de même. 106. Amidons. — Les amidons vont nous offrir des phéno- mènes du même ordre. A l'état d'empois préparé à aussi basse température que possible, de façon à contenir un minimum de sucre, ils peuvent remplacer le sucre dans le liquide Raulin, sans que la plante semble s'apercevoir de la substitution. C'est qu'à l'état normal elle sécrète une diastase liquéfiant l'amidon comme elle sécrète unesucrase intervertissant le sucre. Mais à l'état cru, les amidons sont encore inférieurs au lactose. La germination de la spore ne se fait pas sur un liquide Raulin où l'amidon cru rem- place le sucre, et où l'acide sulfurique remplace l'acide t-artrique. 200 CHAPITRE X Quand on y laisse subsister l'acide tartrique, c'est lui qui ali- mente le premier développement, et assure Favenir de la plante en lui permettant de traverser ce passage difficile. La plante adulte peut, en efTet, corroder et utiliser l'amidon cru, proba- blement à Faide d'une troisième diastase qu'elle sécrète pour cela. Cette corrosion, très irrégulière, dépend des inégalités de résistance des diverses parties du granule. Déplus elle est lente. Bref l'amidon cru est pour Vaspergillus un aliment de disette très difficile à digérer. lO*?. Alcools. — Avec les alcools, nous allons trouver un exemple nouveau, et qui, à son tour, ne restera pas isolé, de la variété de sens que revêt, quand on l'étudié de près^ ce mot unique d^aliment, si souvent employé. Quand on remplace le sucre du liquide Raulin par son équivalent en poids d'alcool ordinaire, la germination des spores se fait non seulement plus mal que dans le liquide Raulin complet, mais encore plus mal que dans ce nieine liquide sans sucre. L'alcool gène donc ou même arrête Faction que pourrait produire Facide tartrique de la liqueur. La plante adulte et le mycélium déjà formé consomment au contraire l'alcool ordinaire aussi aisément que le sucre, et môme la végétation semble en recevoir un coup de fouet. On voit appa- raître autour du tapis noir des spores, partout où il y a un peu de liquide à découvert, un mycélium blanc de nouvelle forma- tion qui pousse ses tubes sporifères et noircit ses capitules à peu près aussi vite qu'il le ferait dans un liquide sucré. La piaule, en outre, se défend mieux contre les parasites. Ce qui est pour eux un antiseptique, ce qui est aussi un antiseptique pourFasy^^y- gillus jeune, est un albnent véritable pour Y aspergilliis adulte, qui peut en supporter jusqu'à 6 à 8 0/0 dans son liquide nourricier. Mais si on s'élève dans la série des alcools, on voit que la dose antiseptique pour la spore, et la dose nutritive pour l'adulte, vont en diminuant à mesure que le poids atomique monte. Avec l'alcool butylique et surtout avec l'alcool amylique, on a tout de suite des effets toxiques, même sur l'adulte. Tous ces résultats témoignent que l'action de l'alcool ne diffère pas beaucoup chez Y as'oergillus de ce qu'elle est chez les êtres les plus élevés en organisation et en particulier chez l'homnie, ï ALIMENTATION HYDlU)CARBONEE 201 108. Acides volatils. — Les acides volatils provenant de ces alcools l'csseniblent à leurs t;énérHteurs. L'acide acétique peut servira la germination de la spore. Il est toléré et brûlé par la plante adulte à des doses assez considérables, allant juscju'à 8 et 10 0/0 L'acide butyricpic n'est toléré et brûlé qu'à des doses plus faibles, qui ne peuvent guère dépasser 1 à 2 gr. par litre, suivant l'état de vitalité et de jeunesse de la couche niycélienne à laquelle on le présente. Au delà de ces doses, il devient éminem- ment toxic[ue, et à la dose de o gr. par litre, il tue les filaments mycéliens, de façon à les rendre inertes cjuand on les reporte ensuite sur du liquide Raulin. Voilà donc une substance qui est alimentaire, à la rigueur et à faibles doses, pour la plante adulte, et mortelle à des closes supérieures. Nous verrons cjue les autres microbes ressemblent, à ce point de vue, à Yaspergillus niger, et que ceux même cpii fabriquent de l'acide butyrique ne peuvent pas supporter sa présence au-delà d'une certaine proportion très minime. Une matière fabriquée par un microbe dans un procès physiologicjue de nutrition peut donc lui être défavorable lorsque sa propor- tion augmente, et voilà encore une notion que nous reprendrons bientôt avec les détails qu'elle exige. Enfin, comme notre but, en ce moment, n'est encore que de pousser des pointes de divers côtés, et d'amorcer des sujets d'étude, nous pouvons, en comparant la façon dont sont brûlés l'acide acétique et lacide butyrique lorsqu'ils sont mis ensemble à la disposition de la plante, lui demander de nous indiquer ses préférences, et la façon dont elle classe ses aliments. Nous avons déjà vu que lorsque Vaspergillus ^exxi chohiv entre le sucre et l'acide tartrique, il s'adresse d'abord au sucre. De même quand on lui offre à la fois de l'acide acétique et de l'acide butyrique, de l'acide acétique et de l'acide tartrique, c'est l'acide acétique qui est consommé le premier ; puis vient l'acide tartric|ue, puis l'acide butyrique. De même dans un mé- lange d'acide acétique et d'acide lactique, la plante sait encore choisir, et on voit en résumé que son alimentation hydrocarbonée, qui semble si simple, est au fond très complexe. Si nous examinons maintenant ces notions au point de vue des idées générales développées dans ce livre, nous voyons d'abord que Yaspergillus a nettement un.aliment de prédilection, le sac- 202 CHAPITRE X charose ou le glucose, mais qu'eu Fabseuce de cet aliment, il sait se plier à d'autres alimentations, et se priver de ce qu'il préfère sans que cela nuise sensiblement à sa reproduction, c'est-à-dire à ses propriétés héréditaires. Cependant on relève chez lui, à propos des aliments minéraux, une certaine faiblesse congénitale, si, pendant plusieurs générations, le champignon a eu une ali- mentation défectueuse. De même après des ensemencements successifs sur du liquide Raulin ne contenant que de Tacide tartrique comme aliment hydrocar]>oné, les spores perdent leur teinte noire, deviennent verdâtres, et ne reprennent pas leurs caractères primitifs dès leur première culture sur du liquide Raulin normal. Il leur faut pour cela 2 à 3 cultures successives, et nous trouvons là la première aurore de ces intluences hérédi- taires que nous aurons bientôt à étudier avec le détail dont elles sont dignes. BIBLIOGRAPHIE Raulin. Recherches sur le développement d'une mucédinée dan.s un milieu artificiel. Ann. dc.^ Se. nntureUes, 1870. DucLÂUX. Valeur alimentaire de quelques substances pour VituperijUlun nif/rr. Comptes renduH de Ici Sociclé de hioUxiir, LSS.l. — Sur la nutrition intracellulaire. Ami. de rfnstilul Pnsleur.t- HI (188'.)). \ CHAPITRE XI VIE AÉROBIE ET ANAÉROBIE 109. A-spergillus et levure. — Tous les actes nutritifs que nous venons d'étudier chez Vaspergillus sont nettement des pro- cès de combustion, accomplis avec l'oxygène de Tair. C'est pour cela que nous nous sommes tant préoccupés de fournir à la plante des quantités suffisantes de ce gaz. Elle fait servir une par- tie de sa matière alimentaire à créer les parois de ses cellules, à les remplir de protoplasma ; mais tout le reste est brûlé, et passe à l'état d'acide carbonique et d'eau, parfois avec formation inté- rimaire d'acide oxalique qui est brûlé et disparait à son tour. De sorte qu'à la fin, toute la partie de l'aliment consommé cjui ne fait pas partie des tissus du végétal a été gazéifiée et rendue à la nature ambiante. Mise au contact du même sucre, la levure nous fait assister à un spectacle bien difïérent La fermentation peut se faire dans un flacon plein, muni d'un tube de dégagement débouchant sous le mercure, c'est-à-dire tout à fait à l'abri de l'air. De plus l'expérience prouve que dès qu'elle est commencée, le liquide ne conserve plus de traces de l'oxygène qu'il pouvait avoir dissous pendant qu'on le préparait, de sorte que l'air est totale- ment exclu de la réaction. Et cependant il se dégage de l'acide carbonique en quantités considérables. Il y a donc quelque part une combustion, seulement celle-ci ne se fait pas, comme pour Vaspergillus^ au moyen de l'oxygène de l'air, elle n'est pas exté- rieure : nous savons qu'elle est intérieure, c'est-à-dire qu'elle se fait aux dépens de l'oxygène du sucre, par une dislocation de la molécule que traduit la formule classique : cm '-O" = 2C-H'^0 + 2C0^' Le mécanisme de la nutrition de la levure semble donc être tout autre que celui de Yaspergillus, alors que d'un autre coté les 204 CHAPITRE Xt ressemblances physiologiques sont grandes entre ces deux espè- ces. Gomme Yaspergillus, la levure vit bien aux dépens du sucre, sécrète la môme diastase pour le rendre assimilal)le, l'emploie à la formation de tissus qui ont à peu près la même constitution que ceux de la mucédinée. Elle peut, eu l'absence de sucre, se contenter d'autres aliments, empois d'amidon, acide lactique, glycérine, mannite.érythrite,quercite, etc. ; en un mot, non seule- ment elle est aussi polyphage que Vaspergillus, elle se contente encore des mômes aliments, et sa différence la pins essentielle avec lui est qu'elle refuse de vivre aux dépens des alcools, que la mucédinée consomme au contraire avec avidité. Déplus, la levure peut, comme la mucédinée, vivre au contact de l'air, dans un liquide exposé en couche mince au fond d'une cuvette, et alors, sauf qu'elle n'habite pas à la surface du liquide et reste immergée dans les profondeurs, elle se comporte comme Vaspergillus. Elle brûle le sucre avec laide de l'oxygène de l'air, et le poids de plante récoltée est une fraction notable, un quart, un cinquième du poids du sucre disparu. Mais la dissemblance s'accuse tout à fait quand on opère dans un flacon clos, dans lequel ïa^perr/illus suspend son action, tan- dis que la levure semble exalter la sienne. Nous n'insistons pas pour le moment sur cette transition de la vie aérobic à la vie anaéi^obie, nous la retrouverons dans le courant de ce livre. Mais nous devons de suite nous poser et résoudre cette question : la vie anaérobie est-elle foncièrement différente de la vie aérobie ? 1 lO. Relations entre la vie aérobie et la vie anaérobie- — La levure vit pendant la fermentation, c'est-à-dire se développe, crée de nouveaux tissus, entretient le fonctionnement des anciens, bref accomplit un travail positif, et a besoin de trouver pour cela quelque part une source de chaleur. Comme le principal phénomène chimique de la vie dans ces conditions est la fermen- tation, il faut nécessairement que la dislocation chimique dont nous avons donné la formule plus haut se fasse avec dégage- ment de chaleur. Dès lors c'est ce dégagement de chaleur par combustion inléricuve qui est pour la levure ce qu'était pour XcupergiUus le dégagement de chaleur produit par la combinai- son de l'oxygène de l'air avec la matière alimentaire. Et les diffé- X'ences que nous relevions entre les deux espèces microscopiques VIE AEROBIE ET ANAEROBIE 205 disparaissent ou plutôt changent de terrain. Le protoplasina de la levure est organisé à la lois pour vivre au contact de l'air, et pour produire cette dislocation intérieure du sucre et en béné- ficier. Le protoplasma de Y aspergilliis est incapable de fonction- ner hors du contact de Vair. Mais, sauf cette différence, les sour- ces de la vie cellulaire sont les mômes dans les deux cas : c'est un dégagement de chaleur dû à un phénomène de combustion. De cette première conclusion en découle une autre. Cette com- bustion est complète dans un cas, et toute la portion de sucre non utilisée par Yaspcrgillus passe à l'état d'eau et d'acide carbo- nique. Avec la levure^ la combustion est incomplète, et il n'y a de brûlé que la moitié environ du sucre que la levure n'a pas fait servir à la construction de ses tissus. L'autre moitié se trouve à l'état d'alcool, c'est-à-dire de substance encore combustible, pouvant fournir de la chaleur en brûlant. De là résulte que pour alimenter le même fonctionnement vital, pour produire une même quantité de travail chez la levure et chez Y aspergillu s, il faudra que la levure détruise plus de sucre que ne le fait Yaspergillus, pour la raison qui fait que pour obtenir la même quantité de va- peur de deux chaudières voisines, il faudra brûler plus de houille dans celle dont le foyer utilise le plus mal le combustible ou est le moins bien alimenté d'air. A cette conclusion s'en rattache à son tour une autre. La quan- tité de sucre détruit étant, pour le même fonctionnement vital d'un même poids de cellules, plus grande pour la levure que pour Yaspergillus, le rapport du poids de l'aliment détruit au poids de cellules vivantes sera plus grand pour la levure, et, comme c'est à ce rapport que nous avons rattaché le caractère ferment, la levure ^;era, toutes choses égales d'ailleurs, un ferment plus actif que Yaspergilliis. Ainsi nous découvrons, à la suite de Pasteur, trois notions qui se commandent Toute vie anaérobie s'alimente au moyen de la dislocation intérieure d'une matière organique qui est un aliment pour le microl)e qui l'utilise, et se comporte, en présence de son protoplasma, comme une sorte de corps explosif, capable de four- nir de la chaleur en se disloquant et en groupant autrement ses éléments. Ce corps, explosif au contact d'un protoplasma, peut trt's bien ne pas l'être, ou Têtre autrement au regard d'un autre. Moins il donnera de chaleur en se disloquant, plus, d'une ma- 206 CHAPITRE XI ni^'re générale, le microbe qui l'utilise devra en détruire pour suf- fire à son fonclionnement vital, et plus la puissance de ce microbe comme ferment, telle que nous l'avons définie, nous apparaîtra grande. Réduit à ces termes généraux, le raisonnement que nous avons fait est indépendant de toute question de mécanisme. Peuimporte que la transformation du sucre en alcool et en acide carbonique se fasse à lintérieur du protoplasma, ou par une diastase sécré- tée par le protoplasma et pouvant agir en dehors de lui. Si la transformation est diastasique, elle est productrice de chaleur, et par conséquent peut se suffire cà elle-même. Si elle est protoplas- mique, elle se produit juste au point où elle peut être utilisée. Dans les deux; cas, elle est vitale, car elle est accomplie ^jar et pour une cellule vivante, et c'est, pour le moment, tout ce que nous avons besoin de savoir. 111. Etude calorimétrique. — Toutes ces notions se pré- cisent un peu quand on y introduit des nombres. Revenons pour cela au cas de Yasperf/illus vivant d'une vie purement aérobie, par combustion directe d'une partie du sucre. Il est facile de calculer, au moyen des données de la thermo-chimie, ce que donne de chaleur, en brûlant, une molécule de sucre égale à 180 grammes : on trouve 673 calories ; c'est ce que nous expri- merons brièvement en écrivant l'équation de combustion sous la forme suivante : C'^H'-O'' + J 20 = 6G0' -^ 6IT-0 + 673 Ouand la combustion est incomplète, comme c'est le cas pour la levure, la chaleur produite est naturellement moins grande, mais non moins facile à calculer. Elle est donnée par l'équation suivante : C^tr'0«= 2C-IP0 + 2G0,+ 33 Elle est donc environ 1/20 de ce qu'elle était dans le premier cas. Si la levure avait exactement les mêmes besoins que Yas- pergillus, elle devrait donc, pour accomplir le même travail, consommer vingt fois plus de nourriture, avoir un pouvoir fer- ment vingt fois plus considérable. Nous pouvons évidemment maintenant, sans rien changer au VIE AKllOBIE ET ANAEROBIE 207 caractère général de notre raisonnement, le débarrasser de toute considération relative à la vie aérobie ou anaérobie. Il nous dit, en effet,qu'il y a encore dans l'alcool de la chaleur disponi- ble, qu'en pourrait dégager sa combustioncomplète. Mais s'il subit une combustion incomplète, il en dégagera moins, et s'il existe un microbe capable de lui faire subir cette combustion in- complète, même aux dépens de l'oxygène de l'air, ce microbe, quel qu'il soit, aura un pouvoir ferment d'autant plus élevé qu'il ira moins loin dans cette oxydation. Or il existe précisément un microbe, le mycoderme du vinaigre, qui s'accomode très bien de cet alcool dont la levure ne veut pas, qui vit à la surface des li- quides alcooliques comme Vaspergi/lus à la surface des liquides sucrés, mais qui, dans sou action oxydante, s'arrête au terme acide acétique. De sorte que son équation de combustion peut s'écrire CH«0 f 20 = CrHMJ- + H=0 + 113 11 existe de même un autre mycoderme, le mycoderme du vin, agent de combustion comme le précédent, vivant comme lui à la surface du vin et d'autres liquides alcooliques, mais qui pousse du premier coup à son terme la combustion de l'alcool. Son équation de combustion est donc C^^PFO -h 60 = 2CO' + 3IPO +323 Si le mycoderme du vin et le mycoderne du vinaigre avaient les mêmes exigences, il n'auraient pas besoin de détruire la môme quantité d'alcool pour suffire au même travail. Le premier de- vrait en acétifier environ trois fois plus que l'autre n'en brûle. De sorte que le caractère ferment est rattaché maintenant, non au ca- ract''^re aérobie ou anaérobie du fonctionnement protoplasmique, mais, ce qui est évidemment plus général, au caractère complet ou incomplet de l'oxydation accomplie par le protoplasma. Il faut, en effet, toujours faire intervenir le protoplasma dans la conception du phénomène, et ne pas rattacher, comme on le fait trop souvent, le caractère aérobie ou anaérobie à la présence ou à l'absence de l'oxygène. Sans aller loin, nous pouvons trouver dans les levures un exemple de l'utilité de cette réserve. Il y a plu- sieurs espèces de levures, en apparence très semblables, toutes ferments alcooliques, mais qui, en présence de la même quan- i>08 CHAPITRE XI tité d'air, se comportent très difieremnient comme aérobies ou anaérobies. J'ai découvert, par exemple, une levure du sucre de lait qui mène la vie anaérobie dans des conditions ou les autres sont purement aérobies. (^est le protoplasma qui commandetout, et c'est là un point qu'on ne doit jamais oublier. 113. Évaluation de la dépense de construction et de la dépense d'entretien. — Ce premier gradin posé, nous pouvons en établir un autre. (iOmparons pour cela, non plus, comme tout à l'heure, des protoplasmas divers en contact avec une même ma- tière alimentaire, mais le protoplasma d'une môme cellule dans des modes de vie différents, par exemple dans la vie aérobie et dans la vie anaérobie. La levure mise au large contact de l'air dans un li(|uidc sucré se comporte, nous l'avons dit, à peu près comme l'as-pr/'f/il/iis, et consomme rapidement le sucre en augmen- tant beaucoup de poids. Mise au contraire dans un liquide sucré désaéré, elle se multiplie peu, mais la fermentation du sucre dure longtemps. Avec ce que nous savons déjà, nous pouvon^ dire que dans le premier cas, la dépense faite est surtout une dépense de construction de nouvelles cellules ; dans le second, une dépense d'entretien des cellules déjà faites, dépense qui augmente avec la durée de l'entretien, tandis que la dépense de construction est, ou du moins nous apparaît indépendante du temps. Cette distinc- tion n'est faite que pour bien différencier théoriquement les deux dépenses. En réalité, la dépense de construction se mélange tou- jours d'une dépense d'entretien. Mais il peut être utile de les envisager séparément. Imaginons donc que dans un liquide sucré nous introduisions comme semence une quantité /de levure, La multiplication com- mence, et au bout d'un temps T, la quantité de levure est deve- nue L. Si à ce moment nous envisageons ce qui se passe dans le liquide, nous pouvons voir deux phénomènes qui s'y accomplis- sent. D'une part, pendant un temps très court r/T, la levure aug- mente de (/L,etsi nous appelons ni le poids de sucre nécessaire pour édifier l'unité de poids de cellules vivantes, la quantité de sucre consommée de ce chef est évidemment /nflJj. D'autre part, pendant ce même tem[)S (l[\ la (juantité totale L de levure présente vit, et pour son entretien dépense une quan- VIE AKUOHII': KT ANAEIlOlilK 209 tité de sucre égale à //.L.r/r, en appelant /i laquanlilé de sucre que doit consommer pendant Tunité de temps l'unité de poids de levui'e dans les conditions de l'expérience pour se maintenir en bon état physiologique. L'ensemble de ces deux dépenses représente la dépense to- tale dS de sucre pendant le même temps. On a donc : (1) dS = m.dL-\-n.L.dT Pour pouvoir intégrer cette équation, il faudrait connaître la loi de croissance de la levure dans les conditions de l'expérience, c'est-à-dire la relation entre L et T. (iCtte relation n'est pas cons- tante pendant la durée d'une môme expérience. C'est ce que nous avons vu à propos de la loi de multiplication des bactéries. Mais nous avons vu aussi que si on maintenait constantes les condi- tions de la culture, si on fournissait aux cellules toujours la même quantité de la même matière alimentaire à la même température, en éliminant constamment les matériaux uses, les cellules met- traient toujours le même temps à doubler de nombre, de sorte que pour la série des temps : 12 3 4 5 6 etc. On aurait, pour le nombre des cellules, les chiffres suivants : / 21 U 8/ 16/ 32/ 64/ etc. Le poids de plante croit donc en proportion géométrique quand les temps de culture croissent en proportion arithmétique. Ceci donne, dans ce cas, la relation voulue entre L et T, et on trouve, par un calcul simple, que la dépense totale de sucre est alors proportionnelle à l'accroissement de poids delà levure. La dépense d'entretien et la dépense de construction marchent du môme pas.VLais ce sont là des conditions théoriques.Sion veut se rapprocher davantage des conditions réelles, il faut déterminer par l expérience la loi d'accroissement des cellules ensemencées. On n'a à ce sujetque quelques expériences faites sur la levure. Je choisirai celles de Hansen. Elles conduisent à la formule suivante : L = /(H-èr) L'accroissement du nombre des cellules ensemencées, s'il n'y en a pas trop, est proportionnel an carré du temps. 14 210 CHAPITRE XI Cette équation donne : dh='2blTdï d'où en se reportant à l'équation (1) à'^=%nbïMÏ + nl{\ + bT-)d'ï: ce que donne, en intégrant s --= mblT-\' iiU+nlb 7- + C Pour T=:o, la dépense est nulle, donc V,= o. on a donc : S= m (L — /) + nrvii + '^\ S= m{\. — ï) + ~ {\-^bV) + -1111 S = >/? ( L — /) + : nHÏ -]-^-n IT S= w (L — /) 4- ^ riT (L+2/j La dépense de sucre se compose donc de deux termes, l'un proportionnel à la quantité de levure produite L — /, et qu'on peut appeler dépense de construction, l'autre croissant avec le temps et qu'on peut appeler la dépense d'entretien. Si en parti- culier, le poids de cellules introduites comme semence est négli- geable au regard du poids de la récolte, on a : i S = m\u-\--7iUÏ y De même, s'il n'y a pas multiplication de la levure pendantla durée de la fermentation, ce qui est un résultat impossible à at- teindre, mais dont on peut se rapprocher au moyen de certaines dispositions expérimentales, L=^/, et la formule revient à S=?iTL Ce qui revient à dire que la dépense de construction disparait, et que la dépense d'entretien croitproportionnellement au temps, et à la quantité de levure mise en œuvre. 11 faudrait maintenant, pour pouvoir pousser l'étude plus loin, déterminer séparément la valeur des deux coeflicients ni et 7i. On y\E AÉIIOHIK KT ANAÉllOBlE 211 pourrait y arriver par rexpéricncc. Mais il n'y en a pas sur ce point, et nous ne pouvons faire en ce moment qu'une évaluation approximative, suffisante cependant pour l'objet que nous avons en vue. Nous avons dit que î)i représente la quantité de sucre qu'il faudrait employer pour y trouver tous les matériaux constitutifs non azotés de 1 gramme de levure sèche. Si la composition de la partie non azotée de la levure était la même que celle du sucre, on pourrait dire qu'il ne faut que 1 de sucre pour faire 1 de levure sans azote, et un peu plus de 1 de levure azotée. Ceci reviendrait à faire ?)i = l. Mais la levure renferme plus de carljouc que de sucre, 54 ou o5 au lieu de 40. Il faut donc plus d'un gramme de sucre pour faire 1 de levure. D'un autre côté, l'expérience de la levure en liquide sucré exposé au large contact de l'air (109) prouve qu'il en faut beaucoup moins de 4, car avec 4 grammes de sucre on obtient, en 24 heures, un gramme de levure, et dans ce cas, à la dépense de construction est venue se joindre la dépense d'entretien. Concluons que la quantité m est toujours très voisine de l'unité, et que nous l'évaluons probablement par excès en la prenant égale à 2. Dans le cas de l'expérience de tout à l'heure, où nous avons obtenu 25 grammes de levure avec 100 grammes de sucre, la dépense de construction est donc, avec les matériaux perdus, de 50 environ, et la dépense d'entretien de 50. Cela donne pour n, en admettant que 7'= 24 heures et que nous prenions cette durée pour unité. ^ n. 25 = 50 D'où ?i = 6, ce qui revient à dire que la dépense d'entretien de 1 gi'ammc de levure en 24 heures est égal à 6 dans les conditions de large aération réalisées dans l'expérience. Prenons maintenant une trace de la levure produite, et mettons-là en vase clos en présence d'une liqueur sucrée, de façon à lui faire produire une fermentation alcoolique. On peut, en faisant vivre dès l'origine cette semence d'une vie anaérobie, s'arranger de façon qu'elle se multiplie peu, et que, sous le poids final de Ogr. 5, elle fasse fermenter encore 100 gr. de sucre. 212 CHAPITRE XI Mais il lui faudra, par exemple, pour cela 100 jours. Dans ces con- ditions, qui sont à peu près celles dune expérience de Pasteur, on a : 100=:m. O,o+î/i. 0,5. 100 et comme nous avons fait m = 2. 100 = 1 + — D'où w = 6 environ. La dépense d'entretien ne seml)le donc pas beaucoup varier dans ces deux cas extrêmes, pour un même poids de cellules vivantes et pour un même temps ; mai^ la dépense totale est pourtant beaucoup plus grande dans le second, bien que le poids de levure en action soit plus faible, parce que le temps de l'action est beaucoup plus grand. 113. Signe thermochimique de l'action totale. — • Pour terminer ce sujet, nous avons une dernière considération à faire valoir. Nous ne savons pas quel est le signe thermochimique de la transformation de la quantité mh de sucre en la quan- tité L de levure. En d'autres termes nous ignorons si la con- version du sucre en levure produit ou absorbe de la chaleur. De quelques nombres donnés par M. Berthelot, il semble qu'on puisse conclure qu'elle en absorbe. Mais on n'a aucune incerti- tude sur le signe thermochimique du terme qui correspond à la dépense d'entretien. Celui-ci produit nettement de la chaleur, comme nous l'avons vu plus haut : beaucoup dans la vie aérobie, moins dans la vie anaérobie, pour une même dépense de sucre. Mais la réaction, qu'elle se fasse dans le protoplasme, ou par l'intermédiaire d'une diastase sécrétée, est toujours exothermique, et comme, lorsqu'elle l'est le moins, dans la vie anaérobie, la quan- tité de sucre qui correspond à la dépense d'entretien est toujours supérieure, à cause de Tintroduction du facteur T, à celle qui correspond à la dépense de construction, on voit que ce terme donne toujours son signe thermochimique à l'ensemble. 114. Variabilité de la fonction cellulaire. — En résumé, tout acte de vie aérobie, de combustion ou de fermentation, est d'abord et surtout un acte protoplasmique. dans lequel l'oxy- VIE AKIIORIE i:r ANAKROBIE 213 gène est un aliment comme un autre, pouvant être accepté ou refusé suivant les cas, et qui n'a un rôle capital qu'en ce qu'il est, dans tous les cas, une source de force dans sou conflit avec les autres matières alimentaires ou avec une partie de la ma- tière alimentaire qui le fournit. Le passage de la vie aérol)ie à la vie anaérobie, si manifeste chez les levures, n'est qu'un témoignage nouveau de la plasticité du protoplasme chez cer- taines espèces, de la faculté qu'il possède de changer peu à peu, dans une même cellule, son mode d'alimentation. Et cette plasticité, constatée à propos de l'oxygène, conduit à se demander si elle n'existe pas à propos des autres aliments. A ce point de vue, la science semble avoir fait pendant quelque temps fausse route. On a cru, en constatant que la levure faisait partout, aux dépens du sucre, de l'alcool et de l'acide car- bonique, que sa fonction était simple, et cette idée était corroborée par l'équation classique de la fermentation alcoolique CH' X)" =: 2 C'IVO + 2 GO^ qui faisait de la transformation du sucre un phénomène chimique réductible en formule. Quand Pasteur eut montré que ce phé- nomène n'avait pas la simplicité qu'on lui attribuait,, et qu'il s'y produisait constamment de la glycérine et de l'acide succinique, il considéra lui-même ces corps comme provenant d'actions latérales et secondaires, intervenant à peu près toujours dans les mêmes proportions dans l'action principale. C'est Pasteur lui-même qui a contribué le premier à élargir ce point de vue étroit, dans ses recherches sur le mycoderme du vinaigre Nous avons vu que ce microbe oxyde l'alcool de façon k en faire de l'acide acétique. Mais il ne s'arrête pas là. Quand il a épuisé tout l'alcool, il porte son action comburante sur l'acide acétique, c'est-à-dire qu'il brûle à son tour le corps qu'il a produit. Eu d'autres termes, il a comme Y aspergillus deux ali- ments, un aliment de choix, l'alcool, un aliment de disette, l'acide acétique, qu'il dédaigne quand il a de l'alcool, et auquel il ne touche que lorsque l'alcool lui manque. J'ai montré de mon côté que la levure se comporte de même vis-à-vis de la glycérine qu'elle a formée. Elle s'en nourrit lorsque le sucre lui manque. Et dès lors il a paru que cette gly- cérine était un produit intérimaire, et qu'on pouvait donner une 214 VIE AEROBIE ET AN AÉROBIE définition générale cVim produit de fermentation en disant que c'est un corps inattaquable, dans les co]iditions de l'expérience, pour la cellule qui le produit, un corps que la cellule rejette pour le reprendre éventuellement si les conditions changent. A ce point de vue, les actions de fermentation se comportent comme les autres phénomènes chimiques ménagés, par exemple comme les actions de comljustion solaire. Les produits résiduels qu'elles fournissent n'apparaissent que parce qu'ils sont relativement stables dans les conditions de leurformation. Nous allons pouvoir tirer de là, dans le chapitre suivant, une définition de l'aliment. Ce que les actions microbiennes présentent en plus, c'est la plasticité de leur action protoplasmique qui leur permet de reprendre en sous-œuvre, ultérieurement, les matériaux fabri- qués tout d'abord. Et dès lors on se demande si ce changement d'allure du protoplasme ne peut pas se manifester tout de suite dès les premiers moments, et s'il faut attendre avec tous les microbes que l'une des actions soit terminée pour que l'autre commence, comme cela a lieu pour le mycoderme du vinaigre dans son action sur l'acide acétique ou pour la levure dans son action sur la glycérine. C'est la question que nous aurons à étu- dier ensuite. BIBLIOGRAPHIE Pasteur. Etudes sur la bière. Paris 1876. Berthelot. Comples-Rendus de l'Ac. des Se. 3 février 1S79. DUCLA.UX. Pouvoir ferment. Ann. de l'Institut Pasteur, t. IX, pp. 110 et 177. — Sur la nutrition intra-cellulaire, /(/., t. III, p. 415. I CHAPITRE XTI ALIMENTATION DES MICROBES 115. Définition de l'aliment. — Avec ce que nous venons de voir, nous pouvons appeler alimoiit toute matière à laquelle un microbe donné, dans les conditionsde l'expérience, peut emprun- ter les matériaux de son organisation, et la chaleur nécessaire pour se rendre indépendant de la chaleur solaire. Le total de l'action protoplasmique doit-être exothermique, et même, d'ordinaire, il reste un peu de chaleur en excès qui élève la température du mi- lieu en fermentation. Ainsi une cuve à la surface de laquellefonc- tionne le ferment acétique s'échauffe notablement. Il en est de même d'une masse de vendange en fermentation alcoolique. Mais, dans le détail, le protoplasme peut parfaitement s'adresser, pour une partie de son alimenlation, à des substances déjà brû- lées, incapables de fournir de la chaleur par une voie quelconque, à la condition de les faire entrer dans une combinaison nutritive où fîg'urent, en quantité suffisante, des transformations exother- miques. Le ferment nitrique peut, comme l'a montré M. Wino- gradsky, emprunfer son charbon à l'acide carbonique, à la con- dition d'oxyder de l'acide nitreux pour le transformer en acide nitrique. De même, des ferments fixateurs d'azote peuvent em- prunter ce gaz à l'air, à la condition de détruire en même temps, par voie d'oxydation, du sucre ou une autre substance hydrocar- bonée capable de fournir de la chaleur en s'oxydant. Ce qu'un ferment ne peut pas faire^, c'est de prendre simultanément son carbone à l'acide carbonique, son hydrogène à l'eau, son azote à l'air. De tout ou partie de cela les plantes vertes sont seules ca- pables, en principe, grâce à la chlorophylle, ou plus générale- ment aux corps colorés qu'elles contiennent, et qui recueillent et utilisent la chaleur solaire. Dans ces limites, il y a place pour une foule de combinaisons nutritives, dans chacune desquelles il faut tenir compte à la fois 216 CHAPITRI*: XII de la nature du protoplasme et des conditions de l'expérience, température, humidité, lumière, présence ou absence de 1 oxy- gène, etc. L'intervention du protoplasme est évidente : celle des conditions extérieures semble l'être moins, et a souvent été trop méconnue. Elle est pourtant aussi de premier ordre. Le sucre de lait est un aliment pour la levure au contact de l'air, n'en est plus un pour la même levure vivant à l'abri de l'air. Nous avons donné, dans le chapitre précédent, des exemples d'aliments qui ne sont touchés que lorsqu'il n'y en a pas d'autres autour d'eux, et on pourrait en ajouter nombre de pareils. La qualité alimentaire est donc une qualité contingente pour un microbe donné, et non pas, comme on pourrait le croire, une qualité essentielle L'étude de l'aliment ne peut donc pas être faite en elle-même et il faut toujours remonter jusqu'au protoplasma. Si nous en connaissions bien la composition et les fonctions, c'est lui qui nous donnerait la clef des phénomènes. Tout ce que nous en avons découvert n'a abouti jusqu'ici cju'à compliquer leproblème. Nous avons vu, dans le chapitre précédent, que ce protoplasma n'exer- çait pas toujours la même action. Nous allons nous convaincre que dans ses choix, il tient compte de circonstances très délicates auxquelles on n'aurait pas songé à attribuer un rôle, et que nous allons brièvement passer en revue. 116. Influence de la constitution moléculaire. — On sait qu'il existe un grand nombre de sucres, ayant pour formule géné- rale G"H""0" dans laquelle ?i peut être l'un quelconque des pre- miers nombres entiers 1, 2, 3, 4etc. Si on cherche dans cette série ceux des sucres que les levures ordinaires peuvent faire fermen- ter, on ne trouve, d'après Fischer, que les sucres renfermant trois atomes de carbone ou un multiple de 3. Ainsi leglycérose C^F^O^ les hexoses C'^H'"0% le mannononoseC''H'*'0^ peuvent servir d'a- liment anaérobie à la levure, tandis que les tétroses, les pentoses les heptoses et les octoses en sont incapables. Notons que ces sucres authentiques sont attaquables par diverses bactéries, qu'ils le sont même probablement pour la levure dans une vie aéro- bie, et cela nous montre une fois de plus que, dans la considéra- tion de l'aliment, il faut avant tout faire intervenir la nature du protoplasma qui s'en nourrit, et les conditions extérieures de son action. AIJMKMATIO.X DKS MICUOI'.KS 217 J'ai clioisi cet exemple, coinnie je le ferai toujoui's dans cette liiologie générale, parce qu'il est particnlièrenient net et probant. Onpourrait en trouver de tout pareils dans la série des acides gras, des acides-alcools, des celluloses. Les ferments de Facide lacti- que C'H''0^ ne sont pas les mêmes que ceux de l'acide glycéri- que C'IPO* ; ceux de l'acide malique G'IPO'"' ne sont pas ceux de l'acide tartriqne C*ir''0'"', et ainsi de suite. 11 T. Influence de la configuration de la molécule. — La levure va plus loin dans son choix, et dans des corps de même formule et de même constitution, elle a su établirdes distinctions dont la science est parvenue à découvrir le secret. ()n sait que le sucres en C se divisent en aldoses et en cétoses, suivant qu'ils contiennent dans leur molécule le groupe aldéhydique ou céto- nique. Or, parmi les cétoses, il n'y a qu'un sucre fermentescible, le c?-fructose, qui porte d'ordinaire le nom de lévulose, et dont la formule développée est CH*OH . CHOH . CHOU . CHOH . CO . CH'OH = CH'^O'' Dans les aldoses, dont la formule développée est CHM3H . CHOH . CHOH . CHOH . CHOH . COU = CH'-O'^ le r/-mannose et le rf- glucose (sucre de fruits, dextrose) sont facile- ment fermentescibles; le «^-galactose l'est beaucoup moins pourles levures ordinaires, et même n'est pas attaqué, d'après Voit, par les levures les moins actives, comme le saccharonu/ces apiculatiiy . Tous les autres hexoses sont infermentescibles. La chose devient curieuse si on ne se contente pas de la for- mule développée, et si on pousse jusqu'à la formule de conligu- ration. Ainsi d'après Fischer, la structure des 3 hexoses fermen- tescibles est la suivante H H OH OH rZ-glucose CH^OH . C . C . C . C . COH OH Oil H CiH COH H H OH Ot r/ mannose CH'OH . C . C . c: . C OH OH li H 218 CHAPITKE XII II OH OH H fZ-galactose GH-OH . C . G . C . G . COH OH H H OH Tout nouveau chang-ement apporté h la place qu'occupe l'Il, ou le groupe OH autour des 4 atomes dissymétriques du centre de la molécule entraine la disparition du pouvoir de fermenter. Ainsi le f/-talose qui a pour formule H OF ^-talose GH-OH . G . G . G . G . GOH H OH OH OH G . G . G . G OH H H H est, comme on peut le voir, au ^/-galactose, exactement ce qu'est le f/-mannose au ^/-glucose. Or, ces deux derniers hexoses ne gagnent ni ne perdent rien au changement opéré dans leur dernier atome de carbone asy- métrique, ils sont à peu près également fermentescibles, tandis que le f/-galactose, qui l'était peu, ne l'est plus du tout en se transformant en talose. 118. Influence des dîastases protoplasmiques. — Les sucres vont nous fournir l'exemple d'une autre influence. Jusqu'ici nous ne nous sommes occupés que des monosaccharides. A côté de ces sucres, il existe des disaccharides et des polysaccharides : saccharose, maltose, sucre de lait, raffmose, etc. Ces sucres sont des aliments de réserve, que ne peut transformer la cellule qui les a produits ; ils se défendent contre elle et en général contre un grand nombre de microbes en ce qu'ils ne sont pas directement fermentescibles ; ils ont besoin, pour acquérir cette propriété, de devenir des monosaccharides, et seules peuvent s'en nourrir les cellules qui sécrètent les diastases pouvant opérer cette trans- formation, Gette loi semble être sans exception. On avait cru qu'un certain nombre de levures, et aussi la nionllia candida, pouvaient faire fermenter le saccharose sans l'intervertir et le transformer en f/-glucose et ^/-fructose. Fischer et Lindner ont trouvé qu'en broyant cette monilia avec de la poudre de verre, on en extrayait une diastase active, qui y existe en trop faible quantité ou y est ALLMEXTATIOX DKS MICROBES 219 trop peu diffiisible pour se dissoudre dans le liquide de macéra- tion de la plante, où on l'avait inutilement clierchée ; mais elle existe dans le protoplasma, où elle doit évidemment se montrer active. On avait cru de même que le lactose était consommé en nature sans dédouljlement préalalîle, mais on sait aujourd'hui qu'il existe une diastase le transformant en ^-/-glucose et rZ-galac- tose. Le môme fait s'est produit pour le tréhalose, dont M. Bour- quelot a découvert la diastase. En résumé, l'utilisation par un microbe des disaccharides et des polysaccharides est liée à la sécrétion d'une diastase ramenant ces corps à l'état non seule- ment de monosaccharides, mais de monosaccharides utilisables. On arrivera sans doute à des conclusions analogues pour les diverses dextrines et pour les diverses celluloses, de sorte que nous l'encontrons ici une des pièces principales du mécanisme de la nutrition chez les cellules vivantes. Quand il s'agit de mo- nosaccharides, nous ne pouvons que dire : telhexose est fermen- tescible, tel autre* ne l'est pas. Quand il s'agit des disaccharides, nous pouvons aller plus loin et dire ; tel saccharide n'est pas ali- mentaire pour tel microbe par suite de l'absence de telle dias- tase chez ce microbe. Nous avons donc fait un pas. Remarquons cependant que l'égalité se rétablit entre ces deux conceptions s'il est démontré que toutes les actions de fermentation sont, comme le dédoublement du sucre en alcool et acide carbonique, des actions de diastases. La faculté de dédoubler un polysaccharide, comme celle de disloquer une molécule de monosaccharide, tiendrait dans tous les cas à une sécrétion protoplasmique. 119. Influence du pouvoir rotatoire. — Tout nous ramène donc au protoplasma, et même nous pouvons prévoir que ces diastases étant des substances très fragiles au regard de certains agents physiques ou chimiques, l'action de ces agents sur la nutrition cellulaire peut être très puissante. Nous aurons bientôt à développer cette notion. Pour le moment, il y en a une nou- velle qui s'impose. Le protoplasma est un ensemble doué du pouvoir rotatoire, et on sait, par les travaux de Pasteur, que les actions chimiques sont influencées par le pouvoir rotatoire des corps qui y pren- nent part. On peut donc s'attendre à voir intervenir le pouvoir rotatoire d'une substance dans son caractère alimentaire, et c'est 220 CIIAPITUK XII là un fait de trop d'importance pour que nous n'entrions pas à son sujet dans quelques développements. M. Pasteur a fait voir en 1860 qu'en semant des spores d'un peniciUium dans de l'eau qui ne contenait que de l'acide racé- mique comme aliment hydrocarboné, de l'ammoniaque et des phosphates comme aliment minéral, on voyait ces spores se dé- velopper, quoique péniblement, et simultanément la liqueur, d'abord inactive, prendre un pouvoir rotatoire gauche de plus en plus caractérisé. Si lorsqu'elle est arrivée à son maximum, on l'évaporé, on n'y trouve qne de l'acide tartrique gauche Tout l'acide tartrique droit a été brnlé par la muccdinée. Voilà donc qui établit une différence entre deux acides qui ne diffèrent entre eux c|ue par le groupement atomique, A la vérité cette différence n'est pas foncière, car, si on laisse se continuer l'expérience, l'a- cide tartrique gauche est attaqué et détruit à son tour. 11 y a plus. Il faut, pour que ces différences se manifestent, que la végétation mycélienne soit languissante. C'est quand la plante est malade qu'elle se montre difficile. Quand elle est bien portante, les deux tartrates sont brûlés à peu près simultanément. Mais si faible qu'elle soit, la différence est importante à relever, car elle ne peut être attribuée qu'à la disposition asymétrique des atomes de la molécule. En 1858, Pasteur avait vu un bacille se comporter de la même manière et détruire encore l'acide droit de préférence au gauche. Ces expériences ont été étendues par jM. Le lîel, ([ui a étudié l'action de moisissures sur trois produits organiques possédant le pouvoir rotatoire : l'alcool amylique, le méthylpropylcarbinol, et le propylglycol. Le pénicillium pousse assez bien sur un liquide contenant, par litre, 3 grammes d'alcool amylique et 1*^',25 de sels minéraux divers. Quand, au bout de quelques semaines, la végétation verte, d'abord très prospère, semble dépérir, on sépare par dis- tillation l'alcool amylique restant. On constate alors qu'il y a une perte sur celui qu'on avait introduit, et que, de lévogyre, il est devenu sensiblement dextrogyre. La meilleure manière d'inter- préter ce résultat est évidemment d'admettre un dédoublement dans lequel l'alcool gauche serait détruit, l'alcool droit respecté ; c'est, on le voit, le contraire de ce qui a lieu pour l'acide racé- mique. AI.lMl'.NTATION DKS MICIIOHES 2^21 Voici, au contraire, qui rappelle 1" action sur cet acide : M. Le Bel introduit 100 grammes de méthylpropylcai'])iuol, bouillant entre IIG et 120", dans 20 litres d'eau additionnée de 24 gram- mes d'acide sulfurique et de divers sels. Il ne faut pas ajouter de nitrates, car la réduction de Tacide nitrique en ammoniaque diminue trop rapidement l'acidité. Le tout est renfermé dans des flacons de 8 litres, demi-pleins, fermés par une simple feuille de papier à filtrer. La surface, après ensemencement, se couvre de plaques de pcnicilliiun. d'une belle couleur rose, dont le mycélium est très émacié, le protoplasma condensé en granules réfringents, et qui n'arrivent que péniblement à la fructification. On laisse à cette végétation languissante quelques mois pour agir, au bout desquels on distille. On parvient à isoler une couche huileuse qui, rectifiée sur de la potasse, et convenablement fractionnée, passe entre 116 et 120°, et a un pouvoir rotatoire très net à gauche, dont la valeur est malheureusement incertaine, car il n'est pas sûr qu'il ne reste pas encore un peu du méthyl- propylcarbinol initial. Quoi qu'il en soit, on voit que celui-ci est nettement dédoublé, comme l'acide racémique, en un corps droit qui est consommé, et un corps gauche qui reste. Une expérience analogue, mais moins nette, a été faite avec le propylglycol, en solutions à 3 p. 100, additionnées de sels miné- raux et de carbonate de chaux précipité. Cette fois, les espèces actives sont restées plus incertaines. M. Le Bel signale un asper- gillus^ un pénicillium qui a poussé sur un liquide un peu acide, ane espèce qu'il assimile, sans raisons bien apparentes, au hac- terium termo d'Ehrenberg, et qui pousse toujours sur le propyl- glycol bien purifié, enfin deux bacilles indéterminés. Ce phéno- mène semble pouvoir s'accomplir indifféremment sous l'influence de ces espèces diverses L'important est qu'il y ait toujours vie difficile et oxydation incomplète : c'est à quoi on arrive en opé- rant dans des flacons presque bouchés, et en empêchant, par une agitation fréquente, les mucédinées de fructifier, ou les bac- téries de former couche au contact de l'air. Quand les végétations ont agi plusieurs mois, on filtre le liquide et on rectifie dans un appareil à colonne. Quelle que soit la cul- ture, on isole un produit ayant une rotation gauche. Mais ce sont les moisissures qui donnent les meilleurs résultats. Depuis, ces premiers exemples se sont multipliés, étendus et 222 CHAPITKK XII précisés. Bremer a dédoublé au moyen des microbes l'acide ma- lique inactif. Fiscber, en faisant agir le penicilliimi glaucum ou la levure de bière dans certaines conditions sur les sucres inactifs, l'i-glucose, r/-mannose, Fz-fructose, et l'acide i-mannonique^ a dédoublé ces racémiques de façon que le sucre-^ fermente et le sucre-/ reste comme résidu. D'une manière générale, il a môme remarqué que tous les rf-hexoses de la classification sont fermen- tescibles, pendant que les /-liexoses correspondants ne le sont pas. Ceci est relatif à la levure, ou plutôt aux levures essayées dans les expériences, car, dans l'ensemble, il faut évidemment, en vertu de la loi générale de la rotation de la matière que nous avons visée (43), que tous les sucres soient détruits. M. Péré a trouvé des actions plus variées en étudiant le dédoublement de l'acide lactique inactif par les microbes. Percy-Frankland avait vu un bacille attaquer de préférence l'acide lévolactique. Un coli-bacille étudié par M. Péré se comporte tout autrement, et détruit l'acide lactique droit, de préférence, mais sans exclusion de l'autre, et cliose singulière, on obtient le môme résultat quand on expose du lactate de cliaux à la combustion solaire : c'est l'acide lac- tique droit qui est attaqué le premier, puis les deux le sont simul- tanément. Ceci nous ramène aux résultats de M. Le Bel. Il demeure donc acquis que le pouvoir rotatoire d'une substance exerce une action sur sa qualité alimentaire. De cette notion, sur laquelle nous n'insistons pas pour le moment, nous avons à tirer une con- clusion. Un microbe qui fera subir à un sucre la fermentation lactique pourra donner de l'acide lactique inactif, s'il est égale- ment indifférent vis-à-vis de l'acide droit ou de l'acide gauche ; il donnera de l'acide droit s'il peut consommer l'acide gauche, ou de l'acide gauche s'il peut consommer l'acide droit. Dans ces cas, la formation d'un composé actif par fermentation aura pour cause la combustion de l'un des éléments du racémique. Mais il y aura aussi des cas où le caractère droit ou gauche de l'acide lactique produit aura pour origine la dissymétrie originelle du sucre qui sera fourni, et proviendra, par conséquent, non d'un dédoublement, mais d'une transmission directe du groupement moléculaire dissymétrique. Tous ces cas semblent pouvoir se réa- liser. Mais nous devons nous contenter de les signaler ici au point de vue théorique ; nous les retrouverons à leurplace dans le courant aliml:ntati()n dks mickubes 223 de cet ouvrage. Nous avous, muiutenant, à poursuivre notre étude de Falimentation, et à étudier les variations physiologiques des produits qu'elle fournit. BIBLIOGRAPHIE Fischer, Ber. d. d. chem. Gcsdls. t. XXI II, 2 ; XXIV, 2 ; XXVII, 1, Fischer et LiNTNr<:R, /(/., t. xxviii, p. 8034. Voit, Zeilsclu-. f. Biologie t. XXII, p. 149. I CHAPITUE XIII VARIATIONS PHYSI(3L0GIQUES DANS UNE MÊME FERMENTATION 120. Fremières notions. — Dans le courant de ses recher- ches, Pasteur avait rencontré une fermentation sortant du type qui paraissait alors consacré par ce qu'on savait de la fermenta- tion alcooli(jue. C'était la fermentation hutyrique, qui lui fournit des proportions variables d'acide butyrique et d'alcool butylique aux dépens du sucre ou du lactate de chaux. La formation de ces corps est facile à comprendre en partant des deux équations suivantes : Q6^J12QG ^ (ni|8( ). ^ 2C0- + 411 Q6JJUQ6 ^ Q4JJ100 4_ 2C0' + H^O Mais l'expérience n'était quasi jamais d'accord avec ces formu- les. Les proportions d'acide carbonique et d'hydrog-ène étaient variables dans le courant d'une môme fermentation, et de plus ce n'était pas lorsque l'hydrogène était le moins abondant qu'il y avait le plus d'alcool butylique, comme le voulait la logique des formules. Pasteur, en présence de ces irrégularités, avait cru que sa semence était impure, qu'elle était par exemple faite d'un mé- lange de deux ferments. Mais cela n'expliquait pas tout, et il avait abandonné cette étude. Depuis, A. Fitz a trouvé de nombreux ferments montrant la même variabilité, c'est-à-dire donnant des produits variables en qualité et en quantité ; mais il n'avait, lui non plus, assuré dans aucun cas la pureté de la semence, et on peut faire la même objection à tous les savants qui ont obtenu des résultats analo- gues aux siens avant l'introduction des méthodes de purification des cultures. C'est M. Perdrix qui a donné le premier exemj)le authentique d'un bacille pur, et pourtant capable de donner des fermentations très variées. Les produits qu'il fournit aux dépens du sucre sont l'acide acé- VARIATIONS PHYSIOLOGIQUES 225 tique, l'acide butyrique, l'acide carbonique et l'hydrogène. Mais les proportions de ces corps sont très variables, et par suite l'équa- tion qui représente la formule de la réaction est parfois très com- pliquée. Un peut toujours la simplifier à l'aide de quelques re- marques, relatives à ce qu'on appelle l'établissement d'une for- mule. 131. Formule d'une fermentation. — Un premier point à remarquer, c'est qu'une formule n'est définie et ne peut être consi- dérée comme exacte que si on a déterminé tous les éléments dont elle se compose, et si l'expérience est conforme à ses données. Par exemple, pour assurer l'exactitude de la formule de la fermenta- tion butyrique écrite plus haut, il faut être assuré qu'une molé- cule de sucre fournit une molécule d'acide butyrique, deux d'a- cide carbonique et quatre d'hydrogène. A la rigueur, cette der- nière détermination est inutile, car quand on a prouvé qu'une molécule de sucre donne une molécule d'acide butyrique et deux molécules d'acide carbonique, il est clair que le reste ne peut être que quatre molécules d'hydrogène. Mais d'ordinaire on se contente de s'assurer de la présence de l'acide butyrique, parfois on le dose, et on écrit alors de confiance l'équation, sans songer que les éléments du sucre dont on a négligé d'étudier le sort, et qu'on peut grouper sous la forme G^H^O*, peuvent prendre des formes autres que l'acide carbonique et l'hydrogène. L'incerti- tude est encore bien plus grande quand on ne fait pas de dosage, et qu'on ne s'assure pas qu'une molécule de sucre fournit une mo- lécule d'acide butyrique, et non une quantité moindre. Il faut donc en principe, pour être sur d'une équation de fer- mentation, en déterminer tous les éléments, etpar exemple quand, comme pour le ferment de M. Perdrix, il y a des proportions variables d'acide acétique, d'acide butyrique, d'acide carbonique et d'hydrogène, il faut s'assurer d'abord que l'ensemble des pro- duits récoltés équivaut, sauf les pertes dues aux matériaux de construction du ferment, au sucre disparu, c'est à-dire qu'il n'y a pas d'autres corps produits en quantité sensible pendant la fer- mentation. Puis, il faut, en partant du sucre, établir une équation qui représente aussi bien que possible les faits observés. Cette équation, nous l'avons dit; est parfois compliquée. Je prends, comme exemple, la première du mémoire de M. Perdrix. 15 226 CHAPITRE XIII (l)4CC«H^-0'=4-18M-"0 = 38C-tPOH-15C'H'0' + 94(:O^H-224H Cette formule n'est pas thcoiique, elleestexpérirnentale, comme le montrent les cliilïres suivants. Pour IG^'G de sucre fermenté, on a trouvé : Expérience Calcul Hydrogène Ogr't? 0(,'r46 Acide carbonique 8 04 8 28 Acide acétique 1 77 1 80 Acide butyrique 6 69 6 70 \6, 97 17, 94 La formule est donc exacte. Nous pouvons remarquer, pour la simplifier, que Tacide acétique et l'acide butyrique qui y figurent peuvent, tant au point de vue des calculs que de la thermochi- mie, être considérés comme produits séparément l'un de l'autre aux dépens du sucre. Peu importe, par exemple, pour l'acide acétique, qu'il provienne d'une partie de l'acide butyrique qui, produit pendant une première phase de la fermentation, serait disloqué pendant une seconde phase. Au point de vue de l'établis- sement de la formule définitive, cet acide butyrique intérimaire disparaîtra. Il disparaîtra aussi au point de vue thermochimique, car la chaleur dégagée pendant une réaction ne dépend que de l'état initial et final des éléments, et non point des états intermé- diaires. Nous pouvons donc retrancher de l'équation complexe (1) tout ce qui est relatif à la formation de l'acide butyrique, et si celle-ci s'accomplit suivant la formule : (a) C''H'^0' = C*H«0^ + 2CO^-i-4H on voit que les 38 molécules d'acide butyrique exigeront 38 molécules de sucre, de sorte qu'en retranchant membre à membre l'équation (1) et 38 fois l'équation (a), il reste l'équation plus simple (2) 8C'H'^0'' + 1811^0 = 15C'H'0* + 18C0^ +72H. De même la formation de l'acide acétique peut être retranchée de cet ensemble encore complexe. La formule la plus simple de cette transformation est : VARIATIONS PHYSIOLOGIQUES 227 Eu admettant que ce soit là le mode de décomposition réalisé, nous pouvons encore simplifier l'équation (2) en retranchant 5 fois l'équation (3) et il nous reste : aC'H'-O^ + lSH-O^lSCO^ -h72H Ou en simplifiant encore : (y) C^H'^0'^ + 6H^0 = 6G0-^ + 24H De sorte qu'en résumé, on peut dire que la transformation écrite dans l'équation compliquée dont nous sommes partis peut s'écrire sous la forme abrégée : 38a +0,3 + 37 Au point de vue des nombres, la coïncidence se fait bien, et ne pourrait pas ne pas se faire. Au point de vue thermochimique, il y a une particularité à signaler. Quand on cherche le signe thermochimique des trois réactions a [i et y, on trouve que les deux premières sont exothermiques et aboutissent respectivement à des nombres de calories égaux à 16 et 49. Elles sont donc toutes deux des actions possibles, et l'expérience témoigne qu'elles sont réelles. Mais tel n'est pas le cas pour la troisième, qui amène une consommation de 163 calories. Elle est endother- mique et exige l'absorption d'une certaine quantité de chaleur. Elle ne pourrait donc pas correspondre, à elle seule, à l'action d'un ferment. Mais c'est ici le cas de revenir à la physiologie, et de se rappeler que le protoplasma cellulaire accomplit à la fois cette réaction endothermique et les réactions exothermiques qui raccompagnent. C'est, comme nous l'avons vu, le signe définitif de l'ensemble qui seul importe. Il faut et il suffît théo- riquement qu'il corresponde à un dégagement de chaleur. Or tel est ici le cas, car 16x38 + 49X0 — 163x3 = 361 Ce qui donne encore une production de 8 calories environ par molécule de sucre détruite. 1S3. Etude du bacille amylozyme. — Revenons, avec ces notions, à l'étude du bacille étudié par M. Perdrix. C'est un bacille anaérobie, vivant très bien entre 35 et 40". qui fait fermenter les 228 CHAPITRE XIII sucres et les matières amylacées, mais est sans action sur la cellulose et le lactatc de chaux. C'est en quoi il se distingue de Yamylobacter de M. Van Tieghem, et du vibrion butyrique décrit par Pasteur. Le point de son histoire qui nous intéresse le plus est celui-ci : avec les sucres, les trois actions a [i et y se mélangent chez lui en proportions variables pendant toute la durée de son existence. Pendant les 2 ou 3 premiers jours de la culture dans du bouillon sucré additionné de carbonate de chaux, la formule de son action est approximativement 36a + 10,3 4- 6y Au bout de 9 jours, dans un ballon identique au premier, la formule de la réaction est celle que nous avons prise tout à l'heure comme exemple, c'est-à-dire 38a + 5,S + 3y ' Or l'expérience apprend que la quantité totale d'acide acétique n'a pas varié d'une façon sensible. Ramenons nos deux schémas à représenter la même quantité d'acide acétique, en multipliant le second par 2, nous avons Du V' au 3'" jour 36a + lOp -f ôy Du 1er au O*^ jour 76a + 10[3-[-6y Ce qui donne, du B*' au 9" jour, le schéma 40a La fermentation a donc été, du 3" au 9^ jour, une fermentation exclusivement butyrique, et la formule de la réaction, très com- plexe à l'origine, se simplifie peu à peu. Voici un autre exemple, emprunté à une fermentation de la saccharose d'ans un bouillon de veau additionné de carbonate de chaux, et dans lequel on a ramené les deux schémas à corres- pondre, conformément à l'expérience, à ]a même quantité, ou à peu près, d'acide acétique du V au 5" jour 66a + 12(3 + 3y du l^"" au 10«jour 168a-^ 12|'3H-3y ce qui donne du 5" au 10« jour 102a, c'est-à-dire une fermenta- tion butyrique pure. VARIATIONS PHYSIOLOGIQUES 229 123. Fermentation de l'amidon. — Ces notions n'épuisent pas ce qu'on sait de la variabilité d'action du bacille amylozyme. Quand il fait fermenter de l'empois d'amidon, aux produits pré- cédents se mélangent l'alcool ordinaire et l'alcool amylique, en proportion non négligeable, car ils représentent environ 10 0/0 du poids de la fécule disparue. L'équation de la fermentation devient alors tellement complexe que M. Perdrix n'a pas songé à l'écrire. Nous pouvons très facilement nous représenter ce qui se passe enjoignant aux schémas réalisables par le bacille amy- lozyme les deux suivants, qui jusqu'à plus ample informé com- plètent son histoire (S) C'H^O^ = C*tP»0 + 2 CO^' -h WO De sorte que le clavier des actions possibles du bacille amy- lozyme pourrait s'écrire a, h, c, cl, e, étant des nombres entiers qui peuvent varier de zéro à un chiffre quelconque. Jusqu'ici, nous avons vu que suivant son âge, suivant le milieu de culture, il frappait plus ou moins longuement sur telle ou telle touche, et ceci indépendamment de toute action de l'oxygène de l'air, qui est exclu dès l'origine par le caractère purement anaérobie du bacille. Nous voyons ainsi que ce bacille a une alimentation très variée. Avec le bacillus ethaceticusde Frankland et de ses élèves, il a été le premier exemple authentique de ces microbes polyphages qu'on croyait autrefois rares, sur la foi des notions apportées parla levure de bière, et qu'on sait main- tenant si nombreux. Mais ce qui nous intéresse surtout chez lui, pour le moment, c'est la variabilité de son action quand il s'adresse à une même matière alimentaire. 134. Etude du bacillus orthobutylicus de G-rimbert. — Un exemple plus complet de ces variations physiologiques dans une même fermentation nous est fourni par le bacillus orthobuty- licus étudié par M. Grimbert. C'est encore un bacille anaérobie, qui se présente au microscope sous forme de bâtonnets cylindriques arrondis aux extrémités, et mesurant 3 p. à 6 ]j. de long sur l,o [j. i230 CHAPITRE XIII de large. Lorsqu'il est jeune, il n'est pas rare de rencontrer dans les préparations des bacilles renflés à leur extrémité en battant de cloche. Cette forme disparait à mesure que le bacille avance en âge, et, dans les fermentations vieilles d'une semaine envi- ron, on ne rencontre plus que la forme droite mais nmnie de de spores. Celles-ci sont généralement au nombre de 2 à 3, et se distinguent du protoplasma par leur plus grande réfringence. Cette sporulation correspond à la cessation des mouvements du Fig. 49. Bacille jeune. | Bacille vieux. microbe, qui, lorsqu'il est jeune, est doué d'une mobilité extrême dans les milieux privés d'oxyg'ène. Ses spores résistent k une température de 80" pendant dix minutes ; à 85° elles sont détruites. 11 fait fermenter les substances suivantes : glycérine, mannite, glucose et sucre interverti, saccharose, maltose, lactose, galac tose, arabinose, amidon et pommes de terre, dextrine, inuline. Il est sans action sur le tréhalose, l'érythrite, le giycol, le lactate de chaux, la gomme arabique. Ses produits de fermentation sont, outre CO" et H, l'alcool butylique normal avec un peu d'alcool isobutylique ; l'acide buty- rique normal : l'acide acétique, et dans quelques circonstances un peu d'acide formique. VARIATIONS PHYSIOLOGIUUES 231 Le B. orthobutijlicus se distiiig'ue du Bacillus hutijricm de Pasteur et du B. amylobacler de Van ïieghem en ce qu'il ne fait pas fermenter le lactate de chaux etiju'il n'attaque pas la cellu- lose. De plus il ne se colore en bleu par l'iode à aucune période de son développement. Il se diiiérencie du Bacillus bulijlicus de bitz par la faculté qu'il a de faire fermenter le lactose et 1 amidon, et de ne pas intervertir le saccharose. Enfin la pro- propriété qu'il possède de donner de l'alcool butylique normal avec les divers hydrates de carbone le sépare netteraentdu Bacille ami/loztjme de Perdrix. Mais ces différences physiologiques s'efïacent dès qu'on revient k la chimie^ et les transformations chimiques que peut produire ce bacille sont, comme chez le précédent, figurées par les schémas a, p, y, et S (l SI et 133), en laissant de côté, pour le mo- ment, la production en général insignifiante d'acide formique. Ce qui est curieux, dans le travail de M. Grimbert, c'est l'étude des causes qui font varier la proportion dans laquelle se mélan- gent ces schémas. Ainsi M. Grimbert a relevé : 1" Une influence de la durée de la fermentation : S augmente, à mesure qu'elle se prolonge, tandis que a et ^ diminuent ; 2° Une influence de la réaction du milieu d'ensemencement. Le rapport de a à ^ va en augmentant en milieu neutre et en diminuant en milieu acide ; 3° Une influence de l'âge de la semence qui, empruntée à une fermentation qu'on vient de mettre en marche, donne la prédo- minance à la réaction §, tandis que la production d'alcool butyli- que diminue quand la semence est prise dans une culture vieille, où les bacilles sont à l'état de spores. La marche de la réaction a est inverse ; 4° Une influence de l'éducation de la semence, et du milieu de culture dans lequel on la prend. Cultivé dans de l'inuline, le bacille ne donne que des traces de la réaction S : reporté de ce milieu sur glucose, il y exagère cette réaction S, et donne une quantité d'alcool trois fois supérieure à celle qu'on obtient quand la semence provient d'une culture sur sucre. Inversement, cul- tivé sur glucose, le bacille fournit avec l'inuline cette réaction S en notable proportion ; 3° Une influence de la réaction du milieu pendant la fermen- tation. Quand le liquide s'acidifie, par suite de l'absence de car- 232 CHAPITRE XIII bonate de chaux, S augmente et a diminue : c'est l'inverse quand le milieu reste neutre. Si on ajoute enfin à ces variations celle de l'acide formique qui est un produit de soufl'rance, et qui est souvent brûlé après avoir été produit, si nous ajoutons que ce même bacille, qui ne fournit pas de l'acide lactique aux dépens des sucres, en donne des quantités sensibles avec la glycérine, on en conclura que chez lui la fonction profcoplasmique est très complexe, et qu'il nous éloigne beaucoup de la levure de bière, si exclusive en ap- parence sur le choix de ses aliments et si constante dans son action sur les sucres. 1S5. Complexité de l'action de la levure. — On, a donc le droit de se demander si la levure est une exception, ou si au contraire elle rentre dans la règle générale. Or, c'est ce dernier cas qui se réalise, comme il est facile de le voir. M. Laurent a mon- tré qu'elle pouvait emprunter sa matière nutritive à une foule de substances ternaires et quaternaires. Elle vit très bien dans le lait, et sécrète même une diastase solubilisant la caséine. Ce n'est que dans sa vie anaérobie qu'elle exige des sucres, et certains sucres ; mais, même alors, elle n'est pas tout à fait exclusive, ou du moins, s'il y a des levures qui ne peuvent faire fermenter que le glucose ou le maltose, il y en a qui donnent facilement de l'alcool avec le glucose, le maltose, le saccharose, le lactose. Enfin, même pendant cette vie anaérobie, il y a formation d'acide succinique et de glycérine à propos desquels on peut établir les deux schémas suivants : (a) 7G'H'-^0'^ + 6H^0 = 12G^H«0' + 600=^ + 4 cal. (P) IC'WO' + 6G0- = 12G*H«0'' + 6tP^0 + 518 cal. Ces deux réactions sont toutes deux exothermiques, et on peut admettre qu'elles se superposent en proportions variables i\ l'é- quation classique de la fermentation alcoolique. Pasteur a vu que dans les conditions ordinaires des fermentations de labora- toire, il y avait environ, pour 100 grammes de sucre, 3^'",5 de glycérine et 0,7 gr. d'acide succinique, ce qui donne pour le schéma total, en appelant e le schéma ordinaire de la fermenta- tion alcoolique (133) : 124 £ -i-6a + P VARIATIONS PHYSIOLOGIQUES 233 Ce schéma montre la prédominance notable de la production d'alcool, mais notre conception nous avertit aussi que les pro- portions de glycérine et d'acide succinique peuvent varier entre elles et avec celle du sucre. C'est ce que Pasteur avait observé en effet. Il avait vu, et Macli et Portele ont confirmé ce fait, que la vieille levure donne plus de glycérine et d'acide succinique que la levure jeune. Thylman et Ililger, Rau, ont vu de même que les basses températures diminuent la formation de glycé- rine et non celle d'acide succinique ; que, dans un milieu très nutritif, le poids de la glycérine s'élève et non celui de l'acide succinique. Enfin M. Effront vient de montrer que la propor- tion de glycérine et d'acide succinique varie dans le cours d'une môme fermentation, comme tout à l'heure les proportions d'acide acétique avec le bacille amylozyme de Perdrix ou celui de Grimbert. 136. Ferments lactiques. — On voit par ce qui précède combien est contingent le caractère tiré des produits de la fer- mentation. On croyait autrefois pouvoir définir la levure de bière en disant que c'était le végétal unicellulaire chargé de dédoubler le sucre en alcool et en acide carbonique. J'ai montré, le premier, je crois, qu'il y a d'autres espèces monocellulaires pouvant fabri- quer de l'alcool aux dépens du sucre. Puis on a vu que cette fonction n'est pas également développée chez toutes les levures, et manque chez quelques-unes dans certaines circonstances. Puis on a trouvé qu'elle est le résultat non de l'action de la levure, mais d'une sécrétion de la levure pouvant agir en dehors de la cellule. Dès lors, l'ancienne définition de la levure ne pou- vait subsister, et pourtant la levure est peut-être, parmi les mi- crobes, celui qui est le mieux caractérisé par sa fonction. Que dire des autres? Nous venons de trouver quelques exemples de la contingence des actions qu'ils produisent. En voici encore de plus typiques. M. Péré a étudié quatre microbes qui donnent de l'acide lacti- que aux dépens des sucres ; ce sont : a, un bacille typhique retiré d'une rate de typhoïsant ; 6, un coli-bacille retiré des selles de l'homme; c, un autre coli-bacille retiré des excréments d'un cheval ; f/, un bacille retiré d'un fromage de Brie. Ces quatre bacilles, dont trois au moins (bacille typhique et 234 CHAPITRE XIII coli-bacilles) présentent entre eux de telles ressemblances qu'il faut y regarder de près pour ne pas les confondre, donnent tous de l'acide lactique gauche avec le glucose lorsqu'on ne leur four- nit pas d'autre aliment azoté que des sels ammoniacaux. Mais si on remplace les sels ammoniacaux par de la peptone, deux groupes se forment : a ei b continuent à fournir de l'acide gau- che ; c et (l donnent de l'acide droit. Pour eux, le changement d'aliment azoté est accompagné d'un changement dans l'action sur le glucose. Dans chacun de ces groupes, on peut amener une différenciation nouvelle. « et ô se distinguent en ce que le bacille typhique donne toujours de l'acide lactique, quelque élevée que soit la dose de peptone, tandis que ô donne d'autant moins de cet acide qu'il a à sa disposition plus d'azote albuminoïde, et peut même n'en plus donner du tout. D'un autre côté, dans le second groupe, c ne donne pas de l'acide dextrolactique pur, mais seule- ment un mélange où cet acide domine. De plus, il se comporte comme b en présence d'un excès de peptone. Au contraire d donne toujours de l'acide dextrolactique pur dans la solution de peptone glucosée, et se montre insensible aux variations de la peptone. 197. Résumé. — Donc, plus on pénètre dans l'étude intime du mécanisme de la nutrition, plus on le trouve variable, et plus il est impossible de trouver la caractéristique d'un microbe dans la définition de ses propriétés comme ferment. Et nous n'en som- mes encore qu'au gros du phénomène, à ce qui, dans la vie d'un microbe, représente l'équivalent de la formation de l'alcool et de l'acide carbonique dans l'action de la levure sur le sucre. Quel que soit le mécanisme de cette fermentation, il semble difficile d'admettre que le sucre qui la subit ait pu entrer dans la cons- titution du protoplasme d'une façon aussi infime que les matériaux qui en ont fourni les éléments, que ceux que nous avons appelés matériaux de construction. Ils sont nécessaires à la vie de la cel- lule comme le charbon est nécessaire à la vie d'une machine à vapeur, alors que pourtant il ne fait pas partie de ses organes et se contente d'entrer dans son foyer. Nous trouverons bientôt des différences du même ordre, même plus grandes, en étudiant ce qui, dans la vie de la cellule, repré- sente les phénomènes d'assimilation, d'excrétion, de sécrétion. VARIATIONS PHYSIOLOGIQUES 235 Mais, pour n'avoir pas à nous répéter, nous los étudierons à pro- pos de chacune des influences qui les produisent. Résumons d'a- bord ce que nous venons d'apprendre en disant (ju'une semence qu'on introduit dans un liquide fermentescible apporte des qua- lités héréditaires, dépendant du milieu dont elle provient, du temps quelle y a passé, du degré d'acclimatation qu'elle a subi. Dans son nouveau milieu, elle rencontre des conditions ditl'éren- tes de celles de son milieu d'origine, qui accentuent ou corrigent ses prédispositions héréditaires Bien plus, elle modifie le milieu k mesure qu'elle y vit, de sorte que les cellules qui s'y forment au bout de quelques heures ou de quelques jours apportent elles- mêmes des habitudes et des prédispositions différentes de celles de leurs aînées, et pour tout dire en un mot, d<''S qu'il est démon- tré que le protoplasma d'une cellule n'a pas des propriétés im- muables, nous sommes obligés, à raison de l'impressionnabilité que nous lui avons découverte, de le supposer en état de muta- tion continue. Nous allons voir cette notion se préciser en étudiant de plus près la réaction, sur la cellule du microbe, des substances qu'elle produit elle-même dans le cours de la fermentation, et des conditions dans lesquelles se fait la culture. BIBLIOGRAPHIE Pasteur. Eludes sur la bière. Pari?, 1876. A. FiTZ. Ber. d. d. chem. Gesclh. t. IX, X, XI, XIII, XV. Pkrdrfx. Sur une fermentation produite par un bacille anaérobio de l'eau. Annnlex de l'Institut Pasteur, t. V, 1891. Grimbkrt. Fermentation anaérobie produite par le Bacillus ortholiutylicu.s. Id. t. VII, 1893. Laurent. Nutrition hydrocarbonée et azotée de la levure. Ann. de r Institut Pasteur, t. III, 1889. Thylman et HilgER. Archiv. f. I/i/n. t. VIII, p. 451. Rau. Id., t. XIV, p. 225. Effront. Comptes-rendus de l'jc. des se. ISQC. DUGLAUX. Annales de l'Institut national aip-onomique, 1S79-18S0. Péré. Sur la formation des acides lactifjues isomériques. Annales dcl'lnslilnl Pasteur, t. VII, p. 737. CHAPITRE XIV RÉACTION SUR LE MICROBE DES PRODUITS DE LA VIE CELLULAIRE 1S8. Produits de la vie cellulaire. — Avec ce que nous venons d'apprendre, nous pouvons donner des produits de la vie cellulaire, à quelque classe qu'ils appartiennent, une défini- tion en quelque sorte inverse de celle que nous avons donnée pour l'aliment. Un produit microbien est une substance inatta- quable dans les conditions de l'expérience pour le microbe qui l'a formée, mais qui pourra redevenir alimentaire à son tour si les conditions changent, ou si le microbe revêt de nouvelles propriétés, ce dont nous savons qu'il est fort capable, ou si d'autres microbes interviennent. Ainsi la contingence est par- tout, dans la définition de la matière fermentescible comme dans celle du produit de la fermentation. Tout ce qu'on peut dire de général à ce sujet, c'est que le milieu que se crée le microbe est pour lui de moins en moins nutritif, de plus en plus antiseptique. L'alcool est antiseptique pour la levure, l'acide acé- tique pour le ferment acétique, l'acide butyrique pour les micro- bes de Perdrix et de Grimbert, l'acide lévolactique pour le coli- bacille de M. Péré, qui le produit aux dépens du sucre. C'est là une notion qui, pour être sûre, n'en est pas moins souvent mécon- nue, et que nous allons retrouver en cherchant dans une autre direction. La stabilité des produits d'une fermentation quelconque est relativement assez grande. Cela résulte de ce qu'on trouve ces produits à la fin de toutes les fermentations accomplies dans les mêmes conditions. Si leur stabilité était moins grande, ou si elle devenait très faible, ils ne feraient que passer dans le courant de la fermentation, et on risquerait de ne pas les apercevoir. Tel semble être le cas pour l'acide oxalique et aussi pour l'acide for- mique, dont j'ai signalé la présence intérimaire et intermittente, RÉACTION SUR LE MICIIOBE 237 dans une foule de cas et avec une foule de microbes. Ces acides sont très voisins, comme constitution, de la forme définitive que prend le carbone, l'acide carbonique ; on comprend qu'ils figu- rent souvent à l'état de termes de passage. Il en est de même pour l'urée, que j'ai réussi à trouver chez certains microbes des matiè- res albuminoïdes, et qui est un terme constant, un produit nor- mal des cellules des animaux supérieurs. 1S9. Termes de passage. — Il y aurait évidemment grand intérêt à saisir des termes de passage d'un degré encore plus élevé, et à étudier les fermentations non pas quand elles sont terminées, mais pendant qu'elles durent, pour y rechercher les produits intermédiaires de la dislocation de la matière alimen- taire. Cette étude a été entreprise dans mon laboratoire par M. Péré et voici ses premiers résultats : Il a étudié l'action de 3 microbes, 1" le Tyrothrix tennis de mes études sur le lait, qui est voisin du Bacillus subtilis sans se con- fondre avec lui ; 2" le B. mesentericus vulgatus ; 3° le Bacillus subtilis, ces deux derniers isolés des macérations de foin par le procédé classique. Tous ces microbes peuvent se développer en voile à la surface des milieux nutritifs, et y exercer des actions comburantes qui peuvent devenir très actives. Comme il impor- tait de les modérer, M. Péré a employé le procédé qui lui avait déjà servi ( 136), et qui consiste âne donner aux microbes de l'a- zote qu'à l'état d'azote ammoniacal. On fournit de l'azote orga- nique lorsqu'il s'agit d'arriver à une combustion complète. En étudiant dans ces conditions la combustion ménagée d'al-* cools polyatomicjues tels que la mannite et la glycérine, il a vu que ces corps subissent tout d'abord une oxydation cjui les prive de 2 atomes d'hydrogène, et les transforme en sucres, aldoses ou cétoses, ayant le même nombre d'atomes de carbone que l'al- cool g-énérateur. Les hydrates de carbone complexes, disacchari- des ou amidons, donnent de même des hexoses, sous l'action des diastases microJ)iennes. Puis tous ces sucres ainsi formés, quelle que soit leur origine, leur constitution chimique ou leur structure moléculaire, sont invariablement ramenés sous la forme d'un sucre à trois atomes de carbone, qui est le même pour tous, et fait tourner à gauche le plan de polarisation. Ce sucre est une aldose CH-OH. CHOII. COH. Elle est donc à la fois aldéhvde, 238 CHAPITRE XIV alcool primaire, et alcool secondaire. Elle réduit la liqueur de Fehling comme les sucres, est partiellement volatile comme l'al- déhyde, et, comme elle, est très instable vis-à-vis des alcalis, qui en font du formiate. Elle est aussi très instable vis-à-vis de l'action solaire, surtout en présence des alcalis. Ce sucre C^H'^0^ est lui-même très passager. Il se forme en pro- portions variables pendant la transformation que le produit. Le Ti/rothrix tenuis^ en présence du glucose, commence à le détruire avant que tout le glucose n'ait disparu ; en présence de la glycé- rine, il le laisse d'abord s'accumuler dans le liquide de culture, mais il peut s'habituer à le consommer plus vite, et, par des en- semencements successifs, on peut obtenir un microbe qui détruit le glucose sans donnera aucun moment trace de glycérose. Enfin ce glycérose, bien que sa molécule soit peu compliquée, laisse lui même un produit de combustion intérimaire qu'on peut saisir, c'estl'aldéhyde de formiqueCIrPO, et c'estici que nous retrou- vens notre assimilation entre les produits d'une fermentation et les antiseptiques. Cette aldéhyde formique est, en effet, un anti- septique très actif, qui ne peut par conséquent pas être produit en quantités bien sensibles, mais qui pourtant peut-être con- sommé parle microbe qui l'a produite, comme M. Péré s'en est assuré directement en l'offrant à des cultures prospères de Tyro- thrix tenuis. Le microbe est atteint, le voile qu'il forme se dis- loque et tombe, mais quelques cellules s'acclimatent dans ce nouveau milieu, et finissent par redonner un voile pour lequel l'aldéhyde est un aliment, car elle disparait peu à peu. Dans un travail antérieur, j'avais moi-même constaté que l'acide formi- que se comporte de même. Il est à la fois antiseptique et alimen- taire. Cela dépend de ses proportions, et en outre du degré d'ac- climatation du microbe auquel on le présente. 130. Antiseptique et aliment.— Cette définition, qui rap- proche l'antiseptique de l'aliment, ou du moins qui n'établit entre eux aucune délimitation bien nette, semble au premier abord laisser de côté les antiseptiques les plus connus, ceux auxquels on pense toujours en premier lieu'les sels de cuivre, de mercure, qui semblent, en effet, dépourvus de toute qualité alimentaire. Mais voici qui les rapproche. A quoi l'acide formique, l'aldéhyde formique, par exemple, doi- RÉACTION SUR LK MICROBE 239 vcnt-ils leurs propriétés aiilisopticpios ? Ce n'est certainement i)as à la stabilité tle leur molécule chimique. Ce qui le prouve, c'est d'abord qu'ils sont brûlés à leur tour ; c'est aussi que les formia- tes, par exemple, sont très facilement détruits par beaucoup de microbes aérobies. S'ils ne nourrissent pas de microbes anaé- robies, s'ils ne fermentent pas, c'est que leur transformation en carbonate de chaux est très faiblement exothermique. Ce qui fait que l'acide et l'aldéhyde formiqucs sont inattaquables, c'est qu'à très faibles doses, ils coagulent le protoplasma. On connaît sous ce point de vue l'action puissante de l'aldéhyde formique. En se combinant aux matières animales, elle forme avec elles des combinaisons imputrescibles. Elle se comporte, à faibles doses, comme le tannin et aussi comme les sels de mer- cure. Tout agent de coagulation du protoplasma, capable de con- tracter avec lui une combinaison plus ou moins solide, est un anti- septique pendant que la combinaison persiste. Le caractère an- tiseptique peut donc être revêtu par des substances très diverses. Nous retrouverons, dans une autre partie de cet ouvragé, l'étude des métaux antiseptiques et vénéneux. Bornons-nous, pour le mo- ment, aux antiseptiques alimentaires que nous venons de définir dans les pages qui précèdent, et suivons avec eux cette relation entre l'antiseptique et la coagulation du protoplasma. Toute coagulation implique des notions de qualité et des no- tions de quantité de la substance coagulante. Elle implique aussi des notions d'accommodation. Un protoplasma vivant qui s'est coagulé au contact d'un corps étranger peut se décoaguler, re- prendre son homogénéité et quelques-unes de ses fonctions. Sui- vons séparément ces diverses influences. 131. Influence de la quantité. — Au point de vue de la quantité, la puissance antiseptique augmente avec la dose, ainsi